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钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究
目的 确定致病性问号钩端螺旋体(钩体)属特异性外膜蛋白的抗原性和交叉免疫反应性,为研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒提供依据.方法 采用Ni-NTA亲和层析法,提取了4种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2,并用SDS-PAGE检测表达及提纯效果.上述重组蛋白常规皮下免疫家兔获得抗血清,显微镜凝集试验(MAT)检测各抗血清交叉凝集效价.采用盐变法提取了我国15群问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白.以兔抗血清为一抗,采用Western blot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性.结果 rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达量分别约占细菌总蛋白的10%、40%和35%、15%和10%、30%和15%,各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带.重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性,与不同钩体血清群的MAT效价为1:2～1:128.各血清群钩体外膜中均可检出上述4种外膜蛋白,但LipL21仅存在于问号钩体中.结论 LipL21、LipL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原,可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原.
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中国主要问号钩端螺旋体血清群外膜蛋白OmpL1的基因型,原核表达系统构建表达及免疫学鉴定
目的探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在外膜蛋白OmpL1基因,克隆并构建该基因的原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性. 方法常规酚-氯仿法提取上述钩体的基因组DNA,高保真PCR扩增全长OmpL1基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统,不同浓度IPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白rOMPL1表达情况.分别用兔抗钩体TR/PatocⅠ抗原、rOMPL1血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性.分别用显微镜凝集试验(MAT)和钩体细胞黏附模型检测兔抗rOMPL1血清的交叉凝集效价和细胞黏附阻断作用. 结果上述17株钩体均具有OmpL1基因,但至少可分3种基因型:OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3.与文献报道比较,所克隆的OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3基因核苷酸序列同源性分别为93.87%～94.08%、89.82%～100%和80.89%～81.72%,其氨基酸序列同源性分别为93.13%～98.75%、91.87%～100%和85.63%～88.44%.IPTG诱导后pET32a-OmpL1/1-E.coliBL21DE3和pET32a-OmpL1/2-E.coliBL21DE3的rOMPL1/1和rOMPL1/2表达量分别占细菌总蛋白的30%和20%.rOMPL1/1和rOMPL1/2均能与兔抗钩体TR/PatocⅠ抗原血清发生免疫结合反应,免疫家兔可获得抗体.兔抗rOMPL1/1和rOMPL1/2血清对上述17株钩体的MAT效价为1∶2～1∶32,1∶2～1∶16稀释时均能有效地阻断钩体黏附J744A.1细胞. 结论所检测的钩体均有OmpL1基因,但至少可分为3种不同的基因型.所构建的原核表达系统表达的rOMPL1/1和rOMPL1/2具有良好的免疫原性和免疫反应性.rOMPL1/1和rOMPL1/2具有属特异性、钩体表面的膜蛋白抗原,能诱生交叉凝集抗体,并具有钩体黏附阻断的作用.
