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布鲁氏菌免疫相关抗原研究进展
布鲁氏菌病是世界范围内存在的一种人畜共患传染病,目前许多学者对此展开研究并总结一些瓶颈问题:其一,在动物检疫方面,无法确定被检动物是疫苗接种还是自然感染,这对畜牧业经济造成了很大影响;其二,在疫苗接种方面,人类预防布鲁氏菌感染没有理想的疫苗,使得感染率增加,再加之短时间内临床症状不典型,使得病情极易被延误.针对这两个问题本研究主要介绍了一些布鲁氏菌病诊断相关抗原、疫苗候选抗原和一些热点关注抗原.
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减蛋综合征病毒六邻体重组蛋白的表达和初步应用
减蛋综合征(egg drop syndrome 1976,EDS-76)是由腺病毒科禽腺病毒属Ⅲ群腺病毒即减蛋综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV) 引起的以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的传染病。
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蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用?
为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术(LIPS),本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM?E与荧光素酶融合蛋白,并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板,采用RT?PCR技术扩增prM?E抗原基因,连接到pNLF1?secN质粒上构建真核表达载体pNLF?prM?E,使prM?E蛋白与荧光素酶串联融合表达,并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示,转染重组质粒pNLF?prM?E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达;进而用间接免疫荧光试验( IFA)检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合;在此基础上,用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测,从20份患者血清中检出19份阳性,7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性,可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。
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重组华支睾吸虫诊断抗原研究进展
华支睾吸虫多种诊断抗原的基因已被克隆和重组表达,一些重组抗原已初步应用于华支睾吸虫病的免疫学诊断,显示出较高的诊断价值.
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基因工程表达的EB病毒抗原在鼻咽癌及高危人群诊断中的应用
1967年Henle证明在鼻咽癌病人的血清中存在EB病毒特异性的IgA抗体,近30年来,检测EB病毒壳抗原的IgA抗体是鼻咽癌血清学诊断和高危人群筛查的主要方法,广泛地用于临床诊断和前瞻性血清流行病学研究,在早期发现、早期治疗、提高生存率上起了重要作用(2)。但是,至今仍使用B95-8细胞涂片,以间接免疫荧光或免疫酶方法检查血清中的抗体。检测方法繁琐,细胞中EB病毒其他相关抗原的干扰,影响检测的特异性和敏感性。Luka等人1984年建立了ELISA检测血清中抗体,其敏感性较细胞涂片检测方法提高100~1 000倍(3),但是,从B95-8细胞中提取病毒壳蛋白作为诊断抗原,受细胞中自然表达的EB病毒壳抗原(VCA)量的限制,不可能实际应用,但向人们揭示了以基因工程表达的蛋白作为诊断抗原的
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酶母表达的重组HEV ORF2蛋白在戊型肝炎诊断中的初步应用
戊型肝炎是经消化道途径传播的传染病,对人民健康影响很大,疫苗和诊断抗原的研制和开发是预防和控制其流行和传播的重要手段。戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)结构区蛋白ORF2存在多个抗原性决定簇并可能具有中和抗体的结合位点,因此戊型肝炎病毒基因工程重组蛋白的研制主要集中于ORF2。我们应用巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)成功表达了戊型肝炎病毒结构区蛋白ORF2,制备了新型重组HEV ORF2,将其作为抗原建立酶联免疫吸附试验(简称P-ELISA),检测正常人群及戊型肝炎患者血清中抗HEV-IgG和HEV-IgM抗体,同时以原核细胞表达的重组HEV ORF2建立的ELISA(简称E-ELISA)作为对照,旨在进一步研究酵母表达的重组HEV ORF2蛋白的抗原性,探讨其作为诊断抗原在戊型肝炎实验室诊断中的应用价值。
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幽门螺杆菌标准株NCTC11639 CagA基因的克隆表达及其抗原性的鉴定
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是慢性消化道疾病的主要致病菌[1].本研究利用基因工程技术构建CagA基因并进行了表达,为CagA疫苗和诊断抗原的研究奠定基础.
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应用重组抗原诊断弓形虫病的研究进展
随着分子生物学的发展,对弓形虫重组抗原的研究取得了一系列的进展,多种弓形虫抗原基因通过基因工程手段得以表达并应用于弓形虫防治研究,这些抗原包括膜表面抗原(surface antigen,SAGs)、致密颗粒蛋白(dense granule proteins, GRAs)、棒状颗粒蛋白(rhoptry proteins,ROPs)、微线体蛋白(microneme proteins,MICs)以及基质抗原等[1]。重组抗原在弓形虫病诊断方面的研究一直存在两个方面,一方面是针对每一种抗原进行单独研究以确定其免疫特性,是筛选高效诊断抗原的主要途径,同时对于弓形虫感染机制等方面的研究也有重要意义;另一方面是针对复合抗原的研究以期望克服单一抗原在免疫诊断中的不足,优化得到佳的抗原组合,达到佳的诊断结果。当前人们对于弓形虫重组抗原的研究主要集中于两个方向,一是利用抗原性进行弓形虫免疫学检测,二是利用免疫原性用作疫苗进行免疫保护,本文就弓形虫重组抗原在弓形虫免疫诊断中的新研究进展做一综述。
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胶体金CWSAg-DIPSTICK在检测日本血吸虫病中的应用
[摘要] 目的 研究胶体金CWSAg-DIPSTICK在检测日本血吸虫病中的应用.方法以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEAg)、尾蚴抗原(CeAg)为诊断抗原,采用胶体金CWSAg-DIPSTICK对325例血吸虫病人(其中急性血吸虫病28例,慢性血吸虫病297例),79例肝吸虫病人,157例囊虫病人,184例旋毛虫病人,165例肝炎病人,481例肺结核病人,876例普通就诊者以及518例正常人的临床应用与国内几种常用的血清学诊断方法比较试验.
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Clostridium difficile细胞毒素B羧基末端功能区的克隆与表达
目的:克隆并表达Clostridium diifficile(C difficile)细胞毒素B羧基末端功能区基因,为探索高效的防治C difficile感染的疫苗和诊断抗原奠定基础.方法:提取C difficile染色体基因,用PCR方法扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体PET22b(+),用重组质粒转化大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)],并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用 SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.结果:从C difficile基因组DNA中成功地克隆了毒素B的羧基末端重复区域的1848 bp基因,经过双酶切、PCR和测序鉴定分析,插入到载体的基因与GenBank中公布的C difficile VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%.SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的分子质量为71.3 ku,利用表达载体PET22b(+)表达出蛋白质,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%.结论:含C difficile Toxin B3基因的PET22b(+)重组质粒能高效表达目的基因.该重组子的构建为Clostridium diffiicile相关性疾病的诊断及后期制备疫苗,提供了有力的保障.
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024猪带绦虫:与14和18 kDa相关蛋白的分子克隆及其作为诊断抗原的血清学价值
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细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶B细胞表位的预测及鉴定
目的 预测及鉴定细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶(Echinococcus granulosus lactate dehydrogenase,EgLDH)的B细胞表位,为研制敏感性和特异性强的棘球蚴病诊断方法奠定基础. 方法 通过ESPript 3.0在线网站和IEDB软件对EgLDH的二级结构、β转角、表面可及性、柔韧性、抗原性、亲水性、线性表位等参数进行预测,筛选出具有潜在优势的B细胞表位区域;选取合适的B细胞表位进行体外多肽段合成;通过ELISA方法对合成的B细胞表位进行诊断效能评价,分别检测棘球蚴病患者血清、囊尾蚴病患者血清和健康者血清,评价敏感性、特异性和交叉反应性.用囊液抗原作为对照. 结果 EgLDH二级结构中α螺旋占37.16%,β-折叠占9.67%,无规则卷曲占53.17%,存在4个跨膜区.筛选获得7个潜在的B细胞表位区域.体外合成了4个氨基酸长序列的B细胞表位PP-1 (215~228)、PP-2 (189~200)、PP-4 (79~89)和PP-7 (21 ~~33),ELISA结果显示,4个B细胞表位PP-1、PP-2、PP-4和PP-7对棘球蚴病患者血清的敏感性分别为52.9% (18/34)、61.8% (21/34)、82.3% (28/34)和50% (17/34),PP-4与PP-1、PP-2和PP-7的敏感性差异有统计学意义(x2=8.100、5.143、9.091,均P<0.05),囊液抗原的敏感性为91.1% (31/34),与PP-1、PP-2和PP-7的差异有统计学意义(x2=9.600、5.780、10.530,均P< 0.05),与PP-4的差异无统计学意义(x2=0.444,P> 0.05);对健康者血清的特异性分别为100% (21/21)、100% (21/21)、95% (20/21)和95% (20/21),囊液抗原的特异性为95% (20/21),与PP-1、PP-2、PP-4和PP-7的差异无统计学意义;对囊尾蚴病患者血清的交叉反应性分别为:0、1/10、2/10和2/10,囊液抗原的交叉反应性为5/10. 结论 EgLDH的B细胞表位PP-4对棘球蚴病患者血清有较强的敏感性和特异性,有望成为潜在的诊断抗原.
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用噬菌体十二肽库筛选日本血吸虫病诊断抗原
目的从噬菌体十二肽库中筛选出特异、灵敏的日本血吸虫病诊断抗原.方法以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白(Ig)作为靶分子,免疫筛选噬菌体随机十二肽库.经过3轮吸附-洗脱-扩增的淘筛过程,随机挑取10个蓝色噬菌斑扩增,用ELISA检测其免疫活性,并通过对并殖吸虫病及旋毛虫病患者血清的检测分析其诊断日本血吸虫病的价值.结果6个克隆可以与日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白(Ig)特异结合.其中A492值高的克隆(SjA1)具有较好的特异性和灵敏性.结论从噬菌体随机十二肽库中筛选到的克隆对日本血吸虫病具有较高的诊断价值.
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日本血吸虫特异性抗体与诊断抗原的应用研究进展
血清学抗体检测因检测成本低,操作易掌握,方法较成熟,被广泛应用于日本血吸虫病的辅助诊断和疫情监测.为提高检测的敏感性和特异性、区分病程、考核疗效,已有大量研究用以探索短程抗体及诊断抗原.本文将日本血吸虫特异性抗体、诊断抗原的应用研究进展综述如下.
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多房棘球绦虫原头节蛋白抗原的免疫诊断价值
泡球蚴病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病,病原为多房棘球绦虫幼虫.寻找早期诊断抗原,建立有效的早期诊断方法以便早期发现及早期治疗仍然是提高泡球蚴病患者存活率的重要手段.目前国外已有商品化的Em2plplus-ELISA试剂盒用于泡球蚴病的免疫诊断.该试剂盒对泡球蚴病有较高的敏感性,但与囊性包虫病和囊虫病均有较高的交叉反应,特异性较差[1].近年日本学者Ito等经免疫印迹试验提出Em16/Em18抗原对泡球蚴病具有很高的特异性和敏感性[2,3].但也有与此不同的研究报道[4,5].本文采用多房棘球绦虫原头节蛋白抗原各组分与泡球蚴病及囊性包虫病患者血清进行免疫印迹试验,以评价不同抗原组分的免疫诊断价值.
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猪囊尾蚴蛋白水解酶的初步研究
猪带绦虫病是人畜共患病.迄今国内外对囊虫病的研究主要报道特异性的诊断方法[1,2]和诊断抗原[3,4]Manoutcharian等[5]克隆了肥头绦虫囊尾蚴囊液蛋白编码56、74和78 kDa的保护性抗原基因.孙树汉等[6]以囊虫病患者血清和病猪血清为探针筛选猪囊尾蚴cDNA文库,克隆了用于诊断的人特异性抗原、猪特异性抗原及人、猪共同抗原.关于猪囊尾蚴蛋白水解酶,目前尚未见研究报道.本文从猪囊尾蚴体内提取蛋白酶,研究其对各种底物的分解活性及酶抑制剂和二价阳离子对酶活性的影响.
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高效表达幽门螺杆菌cag A蛋白工程菌的构建
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是引起人类慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌,并与胃癌的发生密切相关.对Hp毒力因子进行的研究表明:尿素酶、空泡毒素(VacA)及细胞毒素相关蛋白A(CagA),是引起人类严重胃部疾患的主要致病因素[1].其中cagA基因已被克隆并进行了序列分析[2].研究还证实cagA基因的存在是产生有活性的空泡毒素所必须的,并能促进细胞因子IL-8的释放及激活转录因子NF-k B,加重胃黏膜的组织损伤,故而目前认为含cagA基因的Hp菌株是高毒株[3].我国人群中,Hp的携带率高达80%左右,胃癌的发病人数每年约20万,约占全世界胃癌发病人数的35%,在Hp分离株中约有97%~98%存在cagA基因,表明我国是Hp高毒株的高感染国[4].为了获得高效表达的幽门螺杆菌CagA蛋白,从而为高毒力Hp的人群普查提供一种具有良好前景的基因工程诊断抗原,我们克隆了该基因的保守区域,对不同诱导条件下CagA蛋白的表达量进行了优化研究,并对CagA蛋白的可溶性表达进行了探索.
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结核分支杆菌诊断抗原ESAT6在大肠杆菌中的表达及纯化
结核病近几年有死灰复燃的趋势,现在全世界每年大约有300万人死于结核病,约800万人患结核病.军队作为特殊群体,结核病总体发病率水平明显高于全国同龄组人群[1],在军队的发病排序中是仅次于肝炎和痢疾的第3大传染病[2].海军舰船上人口密度高,舱室空间相对狭小,一旦传播将很快蔓延,对结核病的早期、特异诊断是控制结核病在舰船上蔓延的关键环节之一.
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细粒棘球绦虫转酮醇酶克隆表达及免疫性分析
目的 通过原核表达获得细粒棘球绦虫转酮醇酶(TK)表达产物,分析其作为棘球蚴病诊断抗原分子的价值.方法 PCR扩增TK基因,克隆至原核载体pMD19-EgTK,随后亚克隆至表达载体pET-28a,构建目的基因TK原核表达质粒pET-28a(+)-EgTK,转入大肠埃希菌BL21,分离纯化蛋白,经SDS-PAGE、Western blotting鉴定后,收集细粒棘球蚴病(CE组)、多房棘球蚴病(AE组)患者及健康人(健康组)血清,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白作为诊断抗原的价值.结果 成功构建pET-28a(+)-EgTK质粒,经SDS-PAGE和Western blotting分析,EgTK蛋白在70 kDa处出现条带,与理论值一致.ELISA显示,CE组、AE组和健康组血清反应吸光度A450值间差异有统计学意义(F=44.47,P<0.01), CE组(1.46±0.41)、AE组A450值(1.28±0.29)高于健康组(0.66±0.23)(P<0.05),但CE组和AE组间A450值差异无统计学意义(P>0.05).结论 重组TK分子可较好地区分棘球蚴病患者和非棘球蚴病患者,但无法区分细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者.
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复合抗原多肽及其在血吸虫病疫苗中的研究进展
人工合成肽是研制分子疫苗和免疫诊断抗原一种替代途径.以含有抗原表位的短肽为基础合成多肽疫苗或诊断抗原,相对于天然或重组的蛋白质抗原,分子结构更为明确,它既保留了诱导免疫保护性应答的活性,又除去了非特异性成分,也易于生产.因此合成多肽研究在近年来已取得了很大的进展[1,2].