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河北省首次实验室确诊恙虫病东方体Kawasaki感染病例
目的 对2017年7月13日恙虫病疑似病例进行实验室检测和分析,了解河北省恙虫病基因型的流行情况.方法 对疑似病例进行流行病学调查,详细询问其病史情况;采集入院时的急性期血清以及2周后的恢复期血清,使用间接免疫荧光法检测血清中的IgG抗体滴度,进行血清抗体滴度分析;提取血液总DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定,运用大似然法构建系统进化树,确定该恙虫病东方体基因型.结果 病例血清中汉坦病毒、新型布尼亚病毒、登革热病毒、伤寒和副伤寒杆菌、无形体、埃立克体以及立克次体抗体均为阴性;急性期血清中抗恙虫病东方体IgG滴度为1∶64,恢复期血清中的滴度为1∶256;PCR扩增获得目的片段测序比对结果显示与恙虫病东方体Kawasaki型序列相似度高,达到99％;该毒株与已知恙虫病东方体Kawasaki具有近亲缘关系.结论 河北省首次实验室确诊存在恙虫病东方体Kawasaki基因型.
关键词： 恙虫病 恙虫病东方体 Kawasaki基因型 间接免疫荧光法 进化分析 -
云南省不明原因发热患者恙虫病东方体实验室检测分析
目的 对云南省不明原因发热患者进行恙虫病东方体检测与分析.方法 应用间接免疫荧光方法(IFA)和PCR(nPCR)法对不明原因发热患者分别进行恙虫病东方体(Or) IgG抗体和sta56基因检测及其基因序列测定分析.结果 在79例发热患者中,Ot IgG抗体阳性率48.10％,Ot核酸阳性率3.80％.基因序列分析显示序列12-17与日本03株同源性高为99.8％,序列12-9与中国台湾KM05、TW45R等株的同源性高均为99.8％,序列11-6与中国台湾KM05、TW45R等株的同源性高均为100％.进化树分析显示序列12-17、12-9和11-6均为Karp型Ot.结论 云南省恙虫病患者中存在Karp型Ot感染,其基因进化来源可能复杂.
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浙江省丽水市监测点鼠类恙虫病东方体的检测
目的 对丽水市莲都区鼠肝脾组织进行恙虫病东方体(Ot)检测,了解该区鼠恙虫病感染情况.方法 收集丽水市鼠的肝脾标本,采用巢式PCR法检测56 kD蛋白基因,确定阳性标本.结果 在丽水莲都区捕获鼠132只,在黑线姬鼠中检测到Ot阳性标本3份,在小家鼠中检测到Ot阳性标本1份,鼠Ot总阳性率为3.03%(4/132).结论 丽水市鼠中存在Ot自然感染,且宿主动物呈多样性,为深入进行恙虫病疫源地的调查奠定了基础.
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云南省部分地区鼠类与人自然感染恙虫病东方体调查
目的 了解云南地区鼠类和人自然感染恙虫病东方体的情况.方法 采用鼠夹和鼠笼捕鼠,从鼠类脾脏及人血中提取DNA,应用巢式聚合酶链反应扩增恙虫病东方体(Ot) sta56基因,并进行基因序列测定分析.结果 捕获小型哺乳动物7属11种485只,收集到不明原因发热病例血液样本23份.从动物脾脏样本中检出Ot sta56基因片段2份(HHSP65和HHSP112),阳性率0.41％;序列分析显示两者同源性100％,而与中国台湾TT071 la株的同源性高为89.6％,与日本Kawasaki株的同源性为79.7％;进化树分析显示HHS65与TT0711a株不在同一分支上.从不明原因发热患者血液样本中检出Ot sta56基因片段1份(DLRX9),阳性率4.35％;序列分析显示该序列与泰国PG9和Li3b株及中国浙江Jin/2012株的同源性高,均为98.4％,与Karp株的同源性为81.9％,与HHSP65株的同源性64.8％;进化树显示DLRX9与泰国PG9和Li3b、中国浙江Jin/2012株在同一分支上.结论 病原学初步证实引发云南地区恙虫病流行的Ot不仅有Karp基因型Ot,还有新型Ot,该新型Ot可能为日本Kawasaki类似株.
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2012-2016年广州市人感染恙虫病东方体基因型与流行病学特征分析
目的 了解广州市2012-2016年人感染恙虫病东方体的基因分型与流行病学特征.方法 收集2012-2016年广州市临床诊断恙虫病患者全血,利用巢式聚合酶链式反应(PCR)扩增56 kDa型特异性抗原基因并测序,通过MEGA 5.0软件构建系统发生树并进行同源性分析.结果 共收集到临床诊断恙虫病患者标本906份,其中220份经巢式PCR检测阳性(阳性率24.3％),包括Karp型138株、Kato型29株、Gilliam型39株和TA763型13株,另有1株未确定型别.两个发病高峰期为5-6月和9-10月,发病区域集中在从化区、增城区等农村地区.结论 近年来广州市恙虫病东方体基因型呈现多样性,但以Karp型为主要流行型,需要加强对恙虫病东方体的分子流行病学监测分析工作.
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2006-2016年我国恙虫病流行特征分析
目的 了解2006-2016年我国恙虫病流行特征,为其科学防控提供依据.方法对中国疾病监测信息报告管理系统2006-2016年恙虫病病例报告进行数据整理,分析其流行特征.结果 我国恙虫病病例诊断主要依据临床症状,实验室确诊病例仅占4.50％.2006-2016年恙虫病发病县(区)数量增加了3.15倍,发病数增加了15.41倍.南方地区流行高峰期为6-10月,北方地区为10-11月.男女性病例数分别占总病例数的46.73％和53.27％,农民占73.58％, 0～6岁学龄前儿童和中老年人所占比例高.结论 我同恙虫病发病数上升趋势明显,南、北方地区发病高峰季节不同,应重点在农村地区进行防治,加强恙虫病诊断技术和传播媒介相关研究.
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恙虫病的流行现状
恙虫病是由恙螨叮咬而感染恙虫病东方体引起的一种媒介生物性传染病,主要在亚洲东南部地区流行.第二次世界大战期间,恙虫病在军队中的流行导致部队大量减员而受到重视,二战后其相关报道逐渐减少.自20世纪80年代开始,恙虫病的发病率呈上升趋势,且分布范围不断扩大.目前,恙虫病不仅在传统流行地区发病率上升,且发病地区不断扩大,甚至在中东、非洲、南美洲和欧洲等非传染病流行地区或国家开始出现病例或动物感染,可能成为当地新发传染病.鉴于我国恙虫病发病率呈上升趋势,建议将其重新列为我国法定报告传染病,以降低其在我国造成的疾病负担.
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恙虫病诊断方法研究进展
恙虫病又称丛林斑疹伤寒,是由恙虫病东方体引起的一种自然疫源性疾病.鼠类为主要传染源,恙螨为传播媒介.恙虫病的临床表现为叮咬部位焦痂或溃疡、发热、淋巴结肿大和皮疹,这些非特异症状极易导致误诊.近年来,分子生物学技术大量应用于恙虫病东方体的检测,有效提高了检测效率和检测结果的准确性.本文对恙虫病的病原学、流行病学以及实验室诊断技术进行了综述.
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中国南海重要岛屿恙虫病疫源地特点调查
目的 研究比较南海重要岛屿(南澎列岛、南澳岛、万山群岛、硇洲岛、雷州半岛)恙虫病疫源地特点.方法 在各岛进行恙虫病疫源地流行病学调查、病原分离与基因型鉴定并制定预防措施.结果 南海诸岛屿均为恙虫病南亚热带岛屿疫源地,主要宿主为褐家鼠,恙虫病东方体携带率为22.78%～33.75%.主要媒介为地里纤恙螨,恙虫病东方体携带率为40.00%～75.00%.从宿主与媒介分离到恙虫病东方体25株,经基因鉴定Karp 15株、Kato 8株、Yonchon 2株.血清流行病学调查表明,各个岛屿村民与驻岛部队人群恙虫病抗体阳性率均较高.结论 南海岛屿恙虫病疫源地存在一定特点,尤其是外来人群要做好防护.
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中国内蒙古、新疆部分地区鼠类自然感染恙虫病东方体的调查
目的了解中国内蒙古、新疆自治区部分地区鼠类自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况.方法采用鼠夹捕鼠,从鼠脾中提取DNA,应用巢式PCR(nPCR)检测Ot-Sta56基因;对部分阳性标本测序,用Clustal Ⅹ(5.0)和DNA Club软件对序列进行比较分析.结果内蒙古地区捕获各种鼠类共计90只,其中6只nPCR检测阳性,总阳性率为6.67%,不同鼠种间阳性率有差别,但无统计学意义(x2=8.898,P=0.148);新疆地区捕获各种鼠类共计20只,其中1只nPCR检测阳性,阳性率为5.00%.不同地区间阳性率比较虽略有差别,但无统计学意义(x2=0.076,P=0.782).内蒙古、新疆部分地区从农田中捕获的鼠类标本为9只,占8.18%,无阳性标本;从草原捕获的鼠类标本为101只,占91.82%,其中阳性标本为7只,草原鼠标本Ot感染率为6.93%.序列分析结果:N59(内蒙古莫氏田鼠)、N69(内蒙古黑线仓鼠)、X33(新疆普通仓鼠)3份标本nPCR产物碱基序列与Karp株相应DNA片段的碱基序列同源性高,均为99%,应属于Karp型;N65(内蒙古黑线仓鼠)及N88标本(内蒙古黑线姬鼠)nPCR产物碱基序列与中国台湾Taitung-2株和TW461株相应DNA片段的碱基序列同源性高,均为94%;N90(内蒙古黑线姬鼠)与日本Oishi株相应DNA片段的碱基序列同源性高,为96%.系统发育分析表明,N59、N69、X33位于Karp株所在的分支,而N65、N88、N90与Taitung-2株、TW461株、Yonchon株、Sxh951株、Oishi株、Kanda株属同一支系.结论研究证实内蒙古、新疆部分地区鼠类存在Ot自然感染,其基因型较为复杂.这为进一步深入进行恙虫病疫源地的调查奠定了基础.
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福建省武夷山林区人群人粒细胞无形体血清流行病学调查
人粒细胞无形体引起的人粒细胞无形体病(humangranulocytic anaplasmosis)是发现于20世纪90年代的一种新发传染病.按新的分类标准[1],无形体属立克次体目,无形体科,变形菌纲,α亚群,人粒细胞无形体与以前命名的马埃立克体和嗜吞噬埃立克体同属无形体科(Anaplasmataceae)无形体属(Anaplasma)中的一个种,即嗜粒细胞无形体(Anaplasma phagocytophila),其主要寄生在人粒细胞的胞质空泡内.
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恙虫病东方体山东分离株Sta56基因全序列扩增及酶切分析
目的 明确山东恙虫病东方体(Ot)分离株Sta56基因全序列与其他已知的序列之间的遗传变异关系.方法 对从山东省费县恙虫病患者、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内分离的3株Ot分离株Sta56基因全序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增;选取4种内切酶HinfⅠ、Hha Ⅰ、HaeⅢ、Pst Ⅰ对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP);对代表株XDM2株Sta56基因全序列测序,运用Clustal X(5.0)和PHYLIP软件对测得的序列与GenBank中已知的Ot序列构建系统发育树,进行比较分析.结果 患者分离株B-16、黑线姬鼠分离株FXS2和小盾纤恙螨分离株XDM2均扩增出接近1.6 kbp的目的条带.Ot山东分离株PCR扩增产物经HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、PstⅠ酶切后图谱一致,但与国际参考株Glliam、Karp、Kato株的RFLP图谱均不相同;虽与日本地方株Kawasaki株的酶切图谱有相似之处,但存在酶切位点的突变.序列同源性分析结果显示,山东地区代表株XDM2株Sta56基因全序列与Kawasaki型相应的序列同源性高,为97%,氨基酸序列同源性为92%.结论 经Sta56基因全序列分析,Ot山东分离株基因型虽与日本Kawasaki型相似,但也存在差异.
关键词： 恙虫病东方体 基因 Sta56 核苷酸限制性片段长度多态性分析 序列测定 -
我国恙虫病东方体分子流行病学研究进展
恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)引起的以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床表现的一种自然疫源性疾病.在我国恙虫病流行原仅限于长江以南广大地区,但自1986年以来,秋冬型恙虫病作为一种新发传染病,于我国北方地区出现暴发和流行[1].2006-2010年我国恙虫病报告发病率分别为0.09/10万、0.1/10万、0.19/10万、0.24/10万和0.31/10万,流行强度逐年增加[2].恙虫病的流行特征、临床严重程度与感染Ot的型别有关[3].为此笔者主要从近年来对我国Ot表型和基因型的分布概况、相关分子生物学研究进展概况予以综述.
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山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体的分子流行病学调查
目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体(Ot)情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性.方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定.结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带.对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份(LHGM2株)为Karp型.序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果:XDM2株首轮PCR产物碱基序列与Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性高,为97.00%,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型;LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性高,为96.45%,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型.结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型.
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山东地区恙虫病东方体分离株的基因分型与序列分析
目的 鉴定山东地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列.方法 以日本、韩国常用的恙虫病东方体分型引物,用巢式PCR技术检测恙虫病东方体分离株的相对分子质量(Mr)56×103蛋白基因片段,对群引物扩增的PCR产物纯化回收后测序,并行序列分析.结果 Gilliam、Karp、Kato、山东分离株用群引物均扩增出481～507 bp的目的片段,Gilliam、Karp、Kato经相应的型引物扩增出了目的片段.山东分离株仅Kawasaki型的分型引物扩增出目的条带,序列分析证实山东分离株与Kawasaki型相似.结论 在国内首次扩增出Gilliam、Karp、Kato三型标准株,山东地区恙虫病东方体分离株为Kawasaki型;山东地区恙虫病东方体与日本的Kawasaki型相似,两者有较近的亲缘关系.
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汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的组织细胞培养研究
目的了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(Ot)在宿主体内共生情况.方法采用Vero E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内共生特征.结果5组感染Vero E6细胞体外培养检测结果发现:先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加.而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加.在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组.其结果均用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定.结论研究结果提示HV和Ot可在同一宿主细胞内共生,在感染初期有相互抑制作用;对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义.
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山东地区恙虫病东方体Sta56基因片段扩增与分型研究
目的鉴定山东地区恙虫病东方体(Ot)基因型别.方法采用巢式聚合酶链反应技术对23株恙虫病东方体山东株、2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及10份恙虫病患者全血中提取的Ot目的基因进行分析研究,并与Tilliam、Karp、Kato国际参考株进行比较.将群引物扩增产物用双向测序法进行序列测定.结果35份标本中33份属于Kawasaki型,2份(FXS4 and LHGM2株)属于Karp型.从这33份中选出B-16、FXS2株进行碱基序列测定,结果B-16、FXS2株Sta56基因片段序列与Kawasaki型同源性高,分别为94.22%、95.21%,而与其他6株Ot同源性均＜75.87%,应属于Kawasaki型;FXS4和HGM2株Sta56基因片段序列与Karp型同源性高,分别为83.03%、96.45%,应属于Karp型.结论山东地区恙虫病东方体流行株以Kawasaki型为主,但同时存在Katp型.
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恙虫病东方体56 kDa抗原基因片段在不同载体的表达
目的构建恙虫病东方体56 kDa表面抗原基因(sta56)片段在不同载体的重组表达质粒,在E.coli中表达sta56重组抗原并比较不同表达系统对sta56的表达效果.方法从含有恙虫病东方体Karp株sta56基因的重组克隆,扩增出不同长度的截短的sta56片段,定向插入pPROEX HTb及pET30a载体,转化大肠埃希菌DH5α或BL21(DE3),IPTG诱导表达,应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白表达情况,应用蛋白印迹(WB)方法分析重组抗原的活性.结果成功构建含sta56不同长度片段的重组表达质粒pHTbOt957、pHTbOt498、pHTbOt342和pETOt957、pETOt498、pETOt342,各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达,SDS-PAGE显示各表达重组子表达不同分子量的重组蛋白,WB证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别.结论恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠埃希菌获得高效表达,pET30a对sta56的表达效果优于pPROEX HTb;重组蛋白具有免疫反应性,纯化后可用作免疫诊断抗原.
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同一疫区汉坦病毒、恙虫病东方体共有宿主和媒介的分子流行病学研究
目的 了解汉坦病毒(HV)和恙虫病东方体(OT)在宿主和媒介体内的共生和自然感染情况.方法 采用现场流行病学调查,捕鼠166只、采螨3829只,用组织细胞培养和聚合酶链反应(PCR)技术从宿主和媒介体内分离和检测HV和OT病原体,以及HV-RNA、OT-DNA.结果 其中,捕获的105只黑线姬鼠中HV阳性3只,OT阳性2只,HV、OT同时阳性2只;41只褐家鼠中HV阳性2只,OT阳性1只,HV、OT同时阳性1只.从15份双重感染HV和OT阳性鼠体螨中分离到HV病原体2株,OT 2株,同时分离到HV和OT有1份.结论 HV和OT可同时自然感染并共生于宿主(鼠类)体内,而HV和OT能否同时感染媒介(恙螨)尚待证实.研究结果对HV和OT的流行和预防有重要的理论意义.
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恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中的表达
采用PCR方法,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增58kDa热休克蛋白的基因,将该基因分别与原核表达载体pQE30及47kDa外膜蛋白的基因重组质粒(pQE30/47)连接,构建pQE30/58及pQF30/58-47重组质粒,用重组质粒转化大肠杆菌.SDS-PAGE显示,pQE30/58和pQE30/58-47转化的大肠杆菌分别产生-58kDa重组蛋白和一90kDa的双抗原(58-47)融合蛋白.免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别58kDa重组蛋白和90kDa融合蛋白,90kDa融合蛋白既与47kDa重组蛋白也与58kDa重组蛋白的免疫血清特异反应,58kDa与47kDa重组蛋白也被90kDa融合蛋白免疫血清所识别.研究结果证明58-47融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株47kDa外膜蛋白和58kDa热休克蛋白的抗原特性.
