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关于脐带血的疑问
广东省脐血库一份冻存长达15年的脐带血造血干细胞成功救治一名11岁急性髓细胞白血病女孩,在刷新了广东省脐血库冻存时间长的脐带血临床应用记录的同时,也成为国内临床应用的脐带血冻存年限之.据了解,这份冻存了15年的脐带血移植前复苏活性检测高达94.2％.2012年3月,北京市脐血库为北京道培医院提供了一份冻存14年的脐带血,这份脐带血是1998年冻存的,解冻时活性达96％以上.它用来救治了一位49岁,体重达87公斤的白血病患者.
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生殖保险知多少
生殖保险是指主动地将自身精子或卵子以冻存方式保存于医疗机构,供以后生育使用.目前,由于卵子冷冻在技术上、伦理上以及法律上还有一些问题尚待解决,而精子的冷冻技术已经成熟,且在伦理、法律等方面都无大的问题,所以目前的生殖保险以男性自身的精子保存即自精保存为主.自精保存是指预先将精液保存于人类精子库,待需要时再进行解冻使用.
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人类胚胎冷冻:真的到了由慢速向玻璃化方法过渡的时代?
自第一例冻融人类胚胎获得妊娠以来,胚胎冷冻已经成为辅助生殖技术中的一项常规操作.近年来,玻璃化冷冻技术成功用于冻存人类卵母细胞及胚胎.那么,玻璃化冷冻方法已经安全到可以广泛应用,甚至可以取代慢速冷冻方法了吗？实际上仍有许多问题有待解决,包括冷冻保护剂毒性、开放式载体的交叉污染、复苏胚胎发育潜能及损伤鉴定等.
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冻存后大鼠精子活力变化与其结构的关系
目的观察冷冻对大鼠精子活动能力的影响,并探讨其活动能力的变化与细胞膜完整性、DNA结构、线粒体鞘和顶体的关系. 方法使用计算机辅助精子活动分析仪(CASA)检测冻存前后大鼠精子活动力的变化;荧光素乙酰乙酸盐(FDA)染色法检测大鼠精子细胞膜的完整性;双氢鲁丹明荧光反应观察精子线粒体鞘的变化;金霉素(CTC)荧光检测法观察冻存对大鼠精子顶体的影响. 结果复苏后精子的活动力下降,为冻存前的39.7%;FDA检测显示冻存后的大鼠精子细胞膜完整,未受到破坏;冻存后的大鼠精子线粒体鞘荧光强度下降,且荧光不连续、甚至消失;CTC荧光反应显示冻存后精子顶体反应(AR)的类型发生改变,AR型精子比例明显下降,由冻存前的68.6%降至冻存后的13.4%. 结论冻存后大鼠精子细胞膜的完整性未受到破坏;精子的线粒体鞘和顶体受到较明显的破坏.大鼠精子冻存复苏后活力下降与线粒体鞘和AR存在相关性.
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-80℃冰箱非程控降温冻存脐血造血干细胞
目的:为脐血造血干细胞(CBHSC)的冻存建立简便、经济且有效的方法.方法:采用5%二甲基亚砜(DMSO)加6%羟乙基淀粉(HES)为冷冻保护剂,不用程控降温装置,直接置CBHSC于-80℃冰箱中冻存1-6个月.结果:冻存6月后,单个核细胞(MNC)、粒-单系造血祖细胞(CFU-GM)和CD34+细胞的回收率及台盼兰拒染率分别为,(91.6±1.8)%、(83.1±15.6)%、(88.2±1.8)%,(77.7±2.0)%.结论:这种简便、经济的方法能很好地保存CBHSC的造血潜能,因此,能为脐血移植冻存CBHSC.
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尸检在医疗纠纷处理中的应用现状及对策分析
近年来,发生死亡的医疗纠纷成为医患双方和社会各界普遍关注的热点.在实际工作中,明确死亡原因是处理这种医疗纠纷首要问题,国务院于2002年9月颁布的<医疗事故处理条例>中明确规定:"患者死亡,医患双方当事人不能确定死因或者对死因有异议的,应当在患者死亡后48小时内进行尸检,具备尸检冻存条件的可以延长到7日.尸检应当经死者近亲属同意并签字."即尸检在解决死因不明的医疗纠纷有强制性的特点,也是裁决死亡医疗纠纷的必经程序.
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破骨细胞的传代、冻存与复苏
目的:探讨破骨细胞传代、冻存与复苏的可行性,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法.方法:破骨细胞的传代:取成年SPF级雄性SD大鼠1只,体重250 g,腹主动脉采血,分离周围血单个核细胞,经RANKL、M-CSF诱导培养2周,形成多核破骨细胞后,采用胰蛋白酶消化、震荡、吹打法,制成细胞悬液,离心后用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔培养板与直径35 mm培养皿中.破骨细胞的冻存:取上述细胞悬液,离心后用DMSO、FBS、α-MEM (1:2:7)冻存液,按常规程序将细胞冻存于-196℃液氮中.破骨细胞的复苏:从液氮中取出冻存的破骨细胞,37℃水浴中快速解冻,加PBS离心清洗后,用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔细胞培养板与直径35 mm培养皿中.同时对传代与复苏培养中破骨细胞的消化与贴壁过程,采用倒置相差显微镜与活细胞工作站进行观察记录与动态成像,3d后作TRAP染色.结果:破骨细胞经胰蛋白酶消化、震荡、吹打后,细胞基本上脱壁、悬浮,可以制成细胞悬液,用于传代与冻存.破骨细胞传代培养后,大多在2h内开始贴壁,贴壁后胞内细胞核清晰可见.经液氮冻存的破骨细胞,复苏培养后2～3 h开始贴壁,胞质展开,可见多个细胞核.传代与冻存复苏培养后的破骨细胞,TRAP染色呈阳性反应.结论:破骨细胞虽然贴壁比较牢固,但经适当的消化、震荡及吹打,多数可脱壁悬浮,并能实现传代培养,同时还可采用常规方法进行细胞冻存与复苏培养,经传代与冻存的破骨细胞仍可保持破骨细胞的活性.破骨细胞的传代与冻存,可以按实验计划与用量需求,随时进行分量传代与复苏培养,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法.
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未密封血清冻融对肿瘤标志物浓度的影响
在日常检验工作中,病人血清检测完毕后要进行冻存,以备日后复查.而在冻融过程中,如果未严格密封,可能会由于试管内凝结水滴而影响结果的准确性.
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不同冻存液保存的颗粒性脂肪组织活力及移植成活率分析
目的 研究以基础培养液DMEM高糖和胎牛血清作为冻存基础液是否有助于提高脂肪组织复温后的存活率及移植后的成活率.方法 分别用1×高糖DMEM培养基和纯胎牛血清作为配制渗透性玻璃化冷冻保护剂的基础液,将脂肪组织放置-180℃液氮中冻存,于冻存2个月后取出脂肪组织,复温后通过肌酸激酶法、锥虫蓝染色、MTT细胞增殖实验和异种移植等方法,比较脂肪细胞的存活率、酶活性及增殖能力,并于体内移植4个月后取出移植物,比较移植物的体积、吸收率、脂肪组织结构等情况.结果 胎牛血清冻存组脂肪组织复温后的存活率、细胞活性、存活能力及移植后的成活率明显高于对照组(P＜0.01).结论 胎牛血清作为冻存基础液能够明显提高冻存脂肪组织复温后的存活率、细胞活性、存活能力及移植后的成活率.
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冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究
为了了解冻存复苏过程对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)生物学特性和支持造血能力的影响,采用常规方法分离培养骨髓MSC,将传代后的细胞用含10%二甲亚砜、40%胎牛血清的IMDM细胞冻存液保存在-196℃液氮中,观察短期(4周)和中期(9-15月)复苏后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力,并同冻存前的MSC进行比较.结果表明:中短期冻存后的MSC的细胞活性分别为(90士3.75)%和(93士2.51)%;冻存后细胞的增殖能力、免疫表型、体外分化为脂肪和骨细胞的能力、支持集落(CFU-GM,CFU-E,CFU-GEMM)的生长作用和冻存前MSC相似.结论:骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后,细胞活性略有下降,但是并不影响MSC的增殖、分化和支持造血能力.
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Immune Cell SR对冻存PBMNC诱导培养CIK的效果研究
目的:探讨Immune Cell SR(血清替代物)在冻存复苏后PBMNC诱导CIK细胞培养过程中的效果,为免疫细胞的工业化生产提供一个新的策略.方法:提取健康志愿者外周血单个核细胞,经短期冻存后复苏并诱导培养CIK细胞,采用台盼蓝拒染法检测细胞活率,流式细胞术分析免疫细胞亚群,并用Calcein-AM/PI双染法检测其杀伤活性;结果:冻存后PBMNC中在对照组未能正常扩增,与新鲜组相比,2％ SR组细胞扩增倍数较低,且差异显著(P＜0.05),5％ SR组、10％ AP组与新鲜组比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);冻存前后CD3+、CD3+ CD8+、CD3+ CD56+细胞亚群比较均无明显差异(P＞0.05);细胞培养后,各组间CD3+、CD3+ CD4+、CD3+ CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD56+亚群及体外杀伤活性比较均无明显差异(P＞0.05);结论:采用5％ SR替代自体血浆可以很好地诱导冻存的PBMNC培养CIK细胞,且无外源性蛋白,安全可靠,为免疫细胞冻存技术在细胞治疗中的应用提供条件.
关键词： 外周血单个核细胞 细胞因子诱导的杀伤细胞 冻存 血浆替代物 -
EB病毒转化B淋巴细胞影响因素的研究
人外周血B淋巴细胞膜上有EB病毒(EBV)受体,在体外可被EBV转化为B淋巴母细胞样细胞系(LCL),LCL具有永生性,能在体外长期传代生长,且能保持较稳定的遗传学性状.因而LCL可被广泛应用于医学生物学研究的许多领域,如进行基因组遗传物质结构的分析,某些细胞生物学性状的检测等.目前建立LCL的方法主要有环孢霉素A法、微量全血法及冻存全血法.但微量全血法和冻存全血法因具有操作简单,所需标本量少的优点,而被广泛采用.我们就影响微量全血法转化效果的因素作了初步探讨.
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冻存神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究
目的 研究冻存大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)异体移植对脊髓损伤(SCI)的修复作用.方法 45只Wistar大鼠于SCI后2 d随机分为A、B、C 3组,每组15只,分别在SCI处注入相同体积的生理盐水、NSCs、低温冻存后复苏的NSCs.术后分别通过免疫组化和组织切片鉴定移植细胞的分化与存活、BBB运动评分和斜板实验评定大鼠功能恢复,细胞存活率,以及评价NSCs低温冻存情况.结果 免疫组化及组织切片显示,B、C组在移植区均有NSCs的特异性表达nestin阳性细胞存活,而A组无表达;脊髓空洞面积A组[(3.9±0.1)mm2]与B组[(1.2±0.3)mm2]和C组[(1.1±0.3)mm2]比较,组间差异有统计学意义(F=423.949,P<0.01),而B、C组间的差异无统计学意义(P＞0.05).BBB评分:A组[(2.0±0.5)分]与B组[(16.4±0.8)分]和C组[(16.0±1.4)分]间的差异有统计学意义(F=970.157,P<0.01),但B、C组间差异无统计学意义(P＞0.05);斜板实验评分:A组[(31.3±2.9)度]与B组[(46.8±2.1)度]和C组[(46.5±2.4)度]间的差异有统计学意义(F=151.099,P<0.01),B、C组间差异无统计学意义(P＞0.05).低温冻存后复苏液的NSCs细胞存活率[(55.9±5.2)%]与未冻存[(65.1±3.4)%]差异无统计学意义(t=3.334,P＞0.05).结论冻存NSCs复苏后仍具有活跃的增殖和分化潜能,是SCI移植治疗有价值的细胞资源.
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慢型丙型肝炎患者干扰素治疗前后HCV HVR1准种的动态变化
目的:探讨感染HCV1b型慢型丙型肝炎患者HCV HVR1区准种的复杂性与干扰素疗效的关系,以便对干扰素治疗疗效进行预测.方法:应用IFN治疗的慢性丙型肝炎患者共20例,于治疗前、治疗后3 mo、6 mo留取血清,-70℃冻存待测.治疗方案为:干扰能3 mu,3次/wk,肌肉注射,共24 wk.HCV HVR1准种的检测采用单链构象多态性聚合酶链反应法(SSCP法).结果:IFN治疗前,35%(7/20)的患者表现为SSCP低复杂性(SSCP条带数≤3),65%(13/20)表现为高复杂性(SSCP条带数＞3).治疗3 mo后,4例患者HCV RNA阴转,均发生在低复杂性组,其余大部分患者SSCP条带数减少1-2条带.治疗6mo时,7例患者HCVRNA阴转,仅2例发生在高复杂性组.治疗结束时13例(65%)无应答患者中,8例患者SSCP条带数均较治疗前减少,2例无变化,1例恢复到治疗前水平,2例较治疗前升高.结论:HCV HVR1区准种的复杂性可以对IFN治疗进行疗效预测,治疗前准种数少者可预测对IFN治疗有较好的应答.
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慢性阻塞性肺疾病大鼠模型支气管肺组织细胞间粘附分子1及部分中性粒细胞炎症因子的研究
我们探讨细胞间粘附分子1（ICAM-1）、中性粒细胞趋化因子巨噬细胞炎症蛋白2（MIP-2）及中性粒细胞活性产物髓过氧化物酶（MPO）在慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠气道炎症中的作用。 材料与方法 雄性二级Wistar大鼠48只，体重270±20 g，随机分为4组，每组12只。（1）模型组：用每日熏香烟及两次气管内滴入200 μg脂多糖法制作COPD大鼠模型［1］。布地奈德组和异丙托溴铵组先按模型组制备模型。(2)布地奈德组：第8天起每日雾吸布地奈德溶液0.5 mg/ml×4。（3）异丙托溴铵组：第8天起每日雾吸异丙托溴铵溶液0.25 mg/ml×4。（4）对照组：不做任何干预。4周后采用小动物呼吸功能测定仪（北京宣武医院），测定大鼠分钟通气量（VE）、呼气峰流速（PEF）及0.3秒用力呼气容积（ FEV0.3）后，即刨腹抽取腹主动脉血处死动物。于4 ℃离心取血清，-20 ℃冻存。左肺行支气管肺泡灌洗（3 ml×2次，回收率60％～70％），灌洗液（BALF）甩片行细胞计数及分类计数，离心后上清液-20 ℃冻存。取右下肺组织用组织匀浆器在冰浴下制成肺组织匀浆，4 ℃，10 000 r/min 离心15 min，取上清-20 ℃冻存。于右肺中叶矢状面大周径处横贯取材，制成石蜡切片和冰冻切片。
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蜕皮甾酮对人脐带间充质干细胞冻存复苏后生物学活性的影响
目的:研究体外条件下蜕皮甾酮(EDS)对冻存复苏后人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)生物学活性的影响.方法:hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存,6个月后复苏,扩增、传代,分3组培养:空白对照组用普通培养基培养；低剂量EDS组在普通培养基中加入100 μg/ml EDS;高剂量EDS组在普通培养基中加入200 μg/mlEDS.显微镜下观察细胞形态,10 d时计算克隆形成能力,绘制细胞生长0～7 d的细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定hUCMSCs的细胞表面特异标记(CD34、CD45、CD29、CD105),油红O染色及茜素红染色观察hUCMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力.结果:两EDS组克隆形成率约为75％,空白对照组约为40％.生长曲线显示两EDS组增殖速度较空白对照组快,但两EDS组增殖速度相近.流式检测结果显示两EDS组的CD29、CD105阳性率明显高于空白对照组,CD34、CD45呈阴性表达,其表达明显低于空白对照组(P＜0.05),两EDS组之间差异无统计学意义；成骨、成脂分化能力检测发现,各组细胞均能够向脂肪细胞、成骨细胞分化,而高剂量EDS组细胞在未加诱导培养基的情况下仍出现向成骨细胞分化的趋势.结论:在一定浓度范围内,EDS对细胞复苏后恢复细胞活性以及提高存活率方面具有积极作用,但是较高浓度的EDS有诱导细胞向成骨细胞方向分化的趋势.
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人肝细胞的分离、培养和冻存
人肝细胞是生物人工肝的理想细胞来源,决定其治疗效果.本文就人肝细胞分离、培养及冻存进行综述.
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光动力疗法诱导Hela细胞凋亡的实验研究
资料与方法1 一般资料1.1 准备工作:细胞复苏、培养、传代、冻存:人宫颈癌细胞系Hela为贴壁细胞,从液氮中取出冻存的细胞后立即置于37℃水浴中融解.
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不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性比较
目的:比较不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性,找出适合作为种子细胞冻存的兔髓核细胞代次.方法:取3～4月龄新西兰大白兔10只,麻醉后在严格无菌条件下分离胸腰椎间盘(T1/2～L7/S1)髓核细胞,体外传代培养,分别取一、二、三、四、五代细胞冻存2～3个月后复苏,取一代未冻存细胞作为对照组(A组,n=10);一、二、三、四、五代冻存后复苏的细胞作为实验组(分别为B、C、D、E、F组,各组n=10),在相同条件下培养2周,培养第2天时采用台盼蓝染色测定细胞成活率;培养第2d、5d、10d、14d时采用MTT法检测细胞生长活性,采用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖(PG)含量;培养第14d时采用阿利新兰染色法测定糖胺聚糖(GAG)合成总量,用RT-PCR法检测各组细胞Ⅱ型胶原基因的表达情况.检测细胞浓度均为1x10(5)个/ml.采用SPSS 13.0软件进行统计学分析.结果:培养第2d时B、C组细胞成活率接近A组(P>0.05);D、E、F三组细胞成活率明显低于A、B、C组(P<0.05).不同时间点各组细胞均有不同程度的增殖,A、B、C、D四组生长趋势较接近.A、B、C三组相同时间点生长活性比较差异无统计学意义(P>0.05),D组与同一时间点A组比较有显著性差异(P<0.05),E组第10d和第14d以及F组各时间点间比较差异无显著性(P>0.05);A、B、C三组各时间点的PG含量及GAG含量高于相应时间点D、E、F组(P<0.05);A、B、C三组的Ⅱ型胶原基因表达量高于D、E组(P<0.05),明显高于F组(P<0.01).结论:不同代次兔髓核细胞冻存后生物学特性不同,第一、二代细胞冻存后能较好保持髓核细胞特性,可作为种子细胞进行低温保存.
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冻存睾丸活检组织用于卵胞浆内单精子注射
我中心2004年用冻存睾丸组织解冻行卵胞浆内单精子注射(ICSI)6例,现报告如下.
