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传代培养对基于肽质量指纹谱的细菌识别稳定性的影响分析
目的 应用肽质量指纹谱技术对多次传代细菌进行识别,分析细菌传代对细菌识别能力的影响.方法 将幽门螺杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌分别连续传57、50、100代,金黄色葡萄球菌留取抗原.每一代新鲜培养菌和冻存抗原通过乙醇/甲酸法提取蛋白,采用肽质量指纹谱技术进行谱图采集和菌株鉴定.进一步采用NanoLC-MS/MS对幽门螺杆菌基于肽质量指纹谱识别的蛋白进行批量鉴定.结果 幽门螺杆菌、大肠埃希菌分别连续传57代和50代,采用肽质量指纹谱每代均能正确识别到种水平;金黄色葡萄球菌连续传100代,采用肽质量指纹谱每代新鲜菌株及冻存抗原均能正确识别到种水平,各代冻存抗原和新鲜菌株的肽质量指纹谱具有很好的一致性.幽门螺杆菌蛋白扫描分析,鉴定出206个蛋白,包括各种酶类(29.6％)、核糖体蛋白(15.5％)、外膜蛋白(10.7％)、假想蛋白(19.0％)、转运相关蛋白(2.0％)、其他蛋白(22.0％).结论 细菌连续传代和抗原冻存不影响肽质量指纹谱对菌株的正确识别,细菌的肽质量指纹谱具有传代稳定性.
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Ⅱ型胶原酶消化分离法和组织块直接培养法体外培养人软骨细胞的效果
目的 比较Ⅱ型胶原酶消化分离法和组织块直接培养法体外培养人软骨细胞的效果.方法 取人外伤性截肢及原发性骨关节炎患者的膝关节软骨,无菌条件下将软骨剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块,分别采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块直接培养法分离培养人关节软骨细胞,进行原代及传代培养,观察软骨细胞的生长情况.结果 采用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养可获得较多软骨细胞,细胞形态典型,增殖较快.组织块直接培养法获得的软骨细胞数量较少,增殖慢.结论 两种不同方法培养后,均可获得人软骨细胞的生长,Ⅱ型胶原酶消化分离培养法明显优于组织块直接培养法.
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昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究
目的:探讨昆明鼠胚胎内细胞团分离方法、原代干细胞克隆分离时机及干细胞传代方法对干细胞建系效率的影响.方法:取昆明鼠3.5d囊胚建胚胎干细胞系,比较全胚培养法与免疫外科法两种内细胞团分离方法对胚胎干细胞建系效率的影响,观察原代克隆的分离时机,机械法传代和酶消化传代对胚胎干细胞建系效率的影响.结果:全胚培养法30个囊胚建系3个,免疫外科法32个囊胚建系4个,两组均可以有效地形成胚胎干细胞系；昆明鼠原代干细胞克隆分离佳时机是增殖4～6 d;5代以前的干细胞以机械传代方法较好,5代后用酶消化法传代效果较好.结论:全胚培养法和免疫外科法均能有效建立昆明鼠胚胎干细胞系,采用机械化与酶消化法相结合传代更适合昆明鼠干细胞建系.
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大鼠滑膜细胞原代培养的研究
目的:建立原代培养大鼠滑膜细胞的方法.方法:取大鼠关节滑膜组织,用酶消化法分离细胞,用RPMI-1640培养液进行培养并传代,观察滑膜细胞生长状况.结果:用酶消化法培养滑膜细胞,方法简单,细胞形态典型.结论:单一的胶原酶消化法是一种有效的滑膜细胞原代培养的方法.
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人支气管上皮细胞体外传代培养方法
目的：探讨一种对人支气管上皮细胞株（16HBE）进行体外培养及传代的新方法。方法用89％1640培养液＋10％FBS （胎牛血清）＋1％双抗对16HBE进行培养；待细胞贴壁后用0.25％胰酶进行消化传代。结果16HBE生长良好，贴壁率达80％以上，传代后呈铺路石样镶嵌。讨论用89％1640培养液＋10％FBS＋1％双抗及0.25％胰酶可成功对16HBE进行传代培养。
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破骨细胞的传代、冻存与复苏
目的:探讨破骨细胞传代、冻存与复苏的可行性,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法.方法:破骨细胞的传代:取成年SPF级雄性SD大鼠1只,体重250 g,腹主动脉采血,分离周围血单个核细胞,经RANKL、M-CSF诱导培养2周,形成多核破骨细胞后,采用胰蛋白酶消化、震荡、吹打法,制成细胞悬液,离心后用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔培养板与直径35 mm培养皿中.破骨细胞的冻存:取上述细胞悬液,离心后用DMSO、FBS、α-MEM (1:2:7)冻存液,按常规程序将细胞冻存于-196℃液氮中.破骨细胞的复苏:从液氮中取出冻存的破骨细胞,37℃水浴中快速解冻,加PBS离心清洗后,用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养基重悬,接种至6孔细胞培养板与直径35 mm培养皿中.同时对传代与复苏培养中破骨细胞的消化与贴壁过程,采用倒置相差显微镜与活细胞工作站进行观察记录与动态成像,3d后作TRAP染色.结果:破骨细胞经胰蛋白酶消化、震荡、吹打后,细胞基本上脱壁、悬浮,可以制成细胞悬液,用于传代与冻存.破骨细胞传代培养后,大多在2h内开始贴壁,贴壁后胞内细胞核清晰可见.经液氮冻存的破骨细胞,复苏培养后2～3 h开始贴壁,胞质展开,可见多个细胞核.传代与冻存复苏培养后的破骨细胞,TRAP染色呈阳性反应.结论:破骨细胞虽然贴壁比较牢固,但经适当的消化、震荡及吹打,多数可脱壁悬浮,并能实现传代培养,同时还可采用常规方法进行细胞冻存与复苏培养,经传代与冻存的破骨细胞仍可保持破骨细胞的活性.破骨细胞的传代与冻存,可以按实验计划与用量需求,随时进行分量传代与复苏培养,为开展破骨细胞的相关研究提供新的技术手段与方法.
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人胚胎干细胞原代克隆生长及其传代的研究
目的评价人胚胎干细胞建系与囊胚质量、原代克隆生长的关系. 方法 D3废弃胚胎成组共培养获得不同质量的囊胚,免疫刀去除囊胚滋养外胚层细胞后,将内细胞团(ICM)接种到饲养细胞层上生长、传代. 结果从质量好的囊胚得到的人胚胎干细胞传代的代数更多;原代克隆生长快的人胚胎干细胞传代效率更高. 结论人胚胎干细胞建系与囊胚质量、原代克隆生长情况密切相关.
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培养时间和传代次数对山羊输卵管上皮细胞周期和凋亡的影响
目的 利用山羊输卵管上皮细胞(OECs)探讨体外培养时间和传代次数对细胞生长的影响.方法 建立山羊OECs的体外培养体系,用流式细胞术分别对半数贴壁、刚贴满(贴壁1d)、贴满3d和贴满5d,以及原代、Ⅲ代和Ⅴ代细胞分别进行细胞周期和凋亡检测.结果细胞贴满3d和传至Ⅲ代时,细胞凋亡比率较低,处于静止期(G0/G1)细胞明显降低,极性线粒体受损明显降低;培养时间延长和传代次数增加后,凋亡比率显著升高,处于增殖期(S,G2/M)的比率显著降低,极性线粒体受损明显升高.结论采用OECs培养胚胎时,细胞应控制在Ⅲ代以内,且贴满时间不超过3d.
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子午沙鼠感染戊肝病毒传代的实验研究
目的：子午沙鼠实验感染HEV的传代研究。方法：选健康子午沙鼠腹腔接种含HEV的人粪便悬液，接种后观察43～50d，分别记录临床表现、酶血症和排毒结果、肝组织学改变。第1代7只，第2、3代各20只，依次进行逐代感染，连续3代。结果：临床表现不明显，酶血症反应3代基本一致，第6d开始，50d渐复常，呈双峰型；肝组织学改变：经光镜和电镜检查显示，与人戊肝病理改变相似。结论：实验证实子午沙鼠可连传3代，有与人类戊肝相似的特征，具动物模型的条件。
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冷冻干燥法保藏放线菌菌株32～39年存活性试验
冷冻干燥保藏法,是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法.文献报道一般保藏时间达5～15年,所以传代转种的间隔是5～10年.国内尚未有保藏时间超过30年的文献报道.本文将1972 - 1979年间采用冷冻干燥法保存的120株菌种复壮,发现此法保藏的菌株经过32～39年的保存,总存活率高达83.3％.
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C亚型SHIV-XJ02170在中国恒河猴体内传代研究
目的 了解SHIV-XJ02170病毒在中国恒河猴体内传代过程中病毒学和免疫学变化特点,构建适用于我国艾滋病疫苗评价的C亚型SHIV/中国恒河猴模型.方法 将SHIV-XJ02170感染性全长质粒转染293T细胞制备病毒,后肢静脉途径在中国恒河猴体内传3～4代.传代过程中采用流式细胞术检测外周血CD4/CD8比值,分析病毒致病能力的变化.实时荧光定量RT-PCR方法 检测SHIV病毒载量,了解病毒学变化特点.同时,利用ELISA和ELISPOT方法 分析病毒传代过程中体液和细胞免疫学变化特点.结果 SHIV-XJ02170病毒传代过程中,CD4/CD8比值未表现出剧烈的下降特点.线路3传代中急性期血浆病毒载量峰值和Setpoint值表现出连续上升的趋势.病毒感染恒河猴后可诱导较强的体液和细胞免疫应答.同时,病毒载量和交叉抗体滴度之间表现出显著的正相关关系.结论 SHIV-XJ02170病毒在中国恒河猴传代后未出现致病性突变株,但是表现出毒力上升的趋势.SHIV-XJ02170/中国恒河猴模型将在我国艾滋病疫苗有效性评价中发挥重要作用.
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实时定量PCR方法监测重组痘苗外源基因传代稳定性
目的 建立实时定量PCR方法 以监测外源基因在不同重组痘苗代次中的稳定性.方法 裂解法提取8个代次插入有HIV基因的重组痘苗DNA,用实时定量PCR的绝对和相对定量方法 ,研究不同代次基因组中插入的外源基因与痘苗基因组的数量关系.结果 绝对和相对定量方法 均证明,在传代过程中,重组痘苗中的外源基因有缺失现象.结论 建立的实时定量PCR方法 可以特异、定量地分析外源基因在重组痘苗中的稳定性.
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SHIV-XJ02170在中国恒河猴体内传代过程中env基因变异研究
目的 研究SHIV-XJ02170在中国恒河猴体内传代过程中env基因序列变异的特点.方法 应用聚合酶链反应(PCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别对各代动物SHIV-XJ02170病毒载量峰值时间点全血前病毒DNA gp160基因和血浆病毒RNA gp120基因进行扩增.GP160基因PCR产物直接进行测序分析,gp120 RNA扩增产物连接T载体后每份样品挑选18个克隆测序,分析传代过程中病毒的基因距离(divergence,diversity)的变化规律及病毒基因进化的特点.结果 SHIV-XJ02170在传代过程中基因连续进化并且进化的方向和病毒传代的顺序完全一致,基因距离总体上表现为逐步扩大的趋势,病毒传代早期存在明显的"瓶颈效应".氨基酸序列分析发现V3环顶端四肽和辅助受体在传代过程中未发生改变.结论 SHIV-XJ02170经过中国恒河猴体内传代后基因距离出现明显扩大过程,且按照传代的顺序发生连续的基因进化.这从分子水平上部分解释了 SHIV-XJ02170经猴体传代出现毒力增强的原因.
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肠道青春双歧杆菌体外传代稳定性研究
目的 考察肠道青春双歧杆菌的传代稳定性.方法 从生长特性、形态学、生化特点、代谢物成分以及核酸组成观察双歧杆菌在传代过程中的变化.结果 双歧杆菌在传代10代其生长特性、生化特点、代谢物组成以及遗传特点无明显改变.结论 青春双歧杆菌在传代10代以内能安全用于生产目的.
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光动力疗法诱导Hela细胞凋亡的实验研究
资料与方法1 一般资料1.1 准备工作:细胞复苏、培养、传代、冻存:人宫颈癌细胞系Hela为贴壁细胞,从液氮中取出冻存的细胞后立即置于37℃水浴中融解.
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皮肤细胞老化的生物标记及其意义
在体外组织培养传代过程中,正常人类细胞逐渐丧失增殖传代能力,终达到一种不可逆的增殖停滞状态,称为细胞老化.有证据表明,体外细胞的老化至少部分反应体内的细胞衰老[1].为研究皮肤老化,先研究细胞老化很必要.目前,在细胞和分子水平发现一些指标,如成纤维细胞体外增殖能力降低,DNA的损伤修复能力降低,线粒体DNA片段的缺失,端粒长度缩短,衰老相关β半乳糖苷酶活性增加,晚期糖基化终产物水平升高,老化相关调控因子的改变等.这些指标作为细胞老化的生物学标志,可用来评价皮肤细胞老化模型的建立是否成功.
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人脂肪基质细胞的分离、培养、增殖及传代稳定性
目的:建立人脂肪基质细胞分离、培养及扩增的方法,观察其增殖动力学行为,检测其传代稳定性.方法:通过吸脂术获取人的脂肪组织并分离脂肪基质细胞,在普通培养基中进行培养,观察细胞形态,绘制细胞增殖曲线,用油红O染色显示胞内脂滴生成,并检测其是否向脂肪细胞自动分化.结果:人的脂肪组织中可分离出基质细胞,在体外生长形态类似成纤维细胞;其增殖曲线呈S形.在原代及传代培养中均未见脂肪细胞或胞内脂滴生成.结论:成年人脂肪组织中存在的基质细胞可维持在未分化状态下稳定的增殖和传代.
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与HIV-1共感染的HHV-6毒株的分离、传代培养与鉴定
目的:对一株从中国河南省一名艾滋病患者体内分离的、可在MT4细胞上稳定传代的未知病毒29A进行鉴定,确定该病毒种类及型别.方法:用从该患者外周血单核细胞中分离的病毒株感染MT4细胞,获得可在该细胞上稳定传代的病毒株29A.通过细胞病变特征、电镜观察结果、HIV-1p24抗原检测以及HIV-1 pol区基因扩增结果,对该毒株是否为HIV-1进行鉴别.在电镜下对病毒感染细胞的超薄切片进行观察,发现该病毒呈现疱疹病毒形态特征,因此设计人类疱疹病毒6型(HHV-6)U69、U16/U17、U60/U66三个不同基因片段的特异性引物并进行巢式PCR扩增,对扩增产物进行序列测定和结果分析.结果:该毒株HIV-1 p24抗原检测为阴性;用HIV-1 pol区特异性引物未扩增出目的片段;细胞病变形态不同于HIV-1引起的病变;电镜观察该病毒直径为160～200 nm,明显大于HIV-1,表明该传代株不是HIV-1.用人类疱疹病毒6型(HHV-6)U69、U16/U17、U60/U66等基因的特异性引物均扩增出了目的片段,序列分析的结果表明该毒株为HHV-6病毒B亚型.结论:在国内首次从艾滋病患者的外周血淋巴细胞中分离出HHV-6,为进一步研究HHV-6和HIV-1的相互作用奠定了基础.
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兔半月板纤维软骨细胞的体外去分化研究
目的:比较研究不同代次间兔半月板纤维软骨细胞生物学特性的改变,为构建组织工程半月板和细胞治疗中的种子细胞优选提供进一步的理论和实践基础.方法:采用机械分离与酶连续消化相结合的方法体外分离兔半月板纤维软骨细胞,单层培养传代至第5代.采用相差倒置显微镜和SEM观察各代细胞的形态变化和超微结构,MTT法检测细胞增殖情况并描绘生长曲线,采用细胞化学染色和免疫组化鉴定细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白.结果:半月板纤维软骨细胞原代接种后8～12 h开始贴壁,48～72h大部分细胞贴壁,胞质逐渐展开,细胞变大伸长,形成突起,呈多角形,细胞形态规则,轮廓清晰,镜下观察有立体感,7～10 d后,细胞长满传代.传代后细胞贴壁生长能力和增殖速度明显加快,原代至第2代细胞形态较规则,多呈多角形,大小均一.第3代后随着传代次数的增加,细胞中梭形细胞增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长.第5代分裂相少见,密度稀疏,细胞形态不佳,约80％呈长梭形,分泌和增殖能力下降.SEM示第1代半月板细胞形态规则,呈多极性,表面有突起;第5代细胞形态不规则,多呈梭形.生长曲线可见第4代前半月板细胞生长速度及生长周期均相似,第5代后细胞生长速度减慢,增殖减缓.细胞化学和免疫组化染色分析胶原和蛋白聚糖的表达:随传代的进行,Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达逐渐减弱而Ⅰ型胶原表达逐渐增强.结论:体外单层培养条件下,随着传代的进行,细胞活力逐渐下降,生长速度减慢,传代周期延长,逐渐变为梭形,形态不规则.体外单层培养系统中半月板纤维软骨细胞表型随传代的进行,Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达逐渐减少而Ⅰ型胶原表达逐渐增多,体外单层培养条件下培养的半月板纤维软骨细胞从第3代开始逐渐失去其特异性表型,发生去分化,逐渐变为成纤维细胞的表型.体外单层分离培养的第5代前半月板细胞基本维持纤维软骨细胞的表型和生物学特性,可作为组织工程半月板的种子细胞.
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牛肾细胞的冻存及复苏后连续传代的研究
目的:研究牛肾细胞的冻存及复苏后连续传代的可行性,为轮状疫苗生产提供稳定、一致的细胞基质.方法:将原代牛肾细胞培养至一代消化后冻存,复苏后进行连续传代培养,观察和记录细胞生长情况.从原代开始,每隔5代对牛肾细胞做染色体核型分析,检查牛肾细胞传代稳定性.结果:牛肾细胞冻存后复苏可连续传至15代,细胞增殖数量、培养时间相对稳定,细胞生长良好,细胞形态未发生明显改变;牛肾细胞在传代过程中遗传性状稳定,未发现有染色体缺失或异倍体现象.结论:牛肾细胞冻存复苏后可连续传代培养,能够为轮状病毒疫苗生产提供稳定、一致的细胞基质.
