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维甲酸增加人胚胎干细胞形成拟胚体中生殖细胞特异基因标记
目的 探讨维甲酸在增加人胚胎干细胞(hESCs)形成拟胚体中生殖细胞特异基因标记中的作用. 方法 hESCs在含有维甲酸或无维甲酸的分化液中悬浮培养形成拟胚体,采用实时荧光定量PCR技术检测未分化因子OCT-4及生殖细胞特异性标记VASA、SCP3、GDF9和TEKT1的表达情况. 结果 在拟胚体形成过程中,未分化因子OCT-4表达下降,但生殖母细胞标记VASA、减数分裂标记SCP3及减数分裂后标记GDF9和TEKT1表达均增加.在含有维甲酸的分化系统中,生殖细胞特异性标记表达均增加.培养5d后,生殖细胞特异性标记VASA、SCP3、GDF9和TEKT1分别增加9.3、6.9、7.2和11.8倍. 结论 hESCs具有分化为原始生殖细胞(PGCs)和早期配子的能力.维甲酸能增加hESCs形成拟胚体中生殖细胞特异性标记的表达.
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饲养层分泌碱性成纤维生长因子与支持人胚胎干细胞生长
目的 初步探讨人源性和鼠源性饲养层细胞分泌的碱性成纤维生长因子(bFGF)对人胚胎干细胞(hESCs)未分化生长的影响. 方法 人源性和鼠源性成纤维细胞制备成饲养层(人源性饲养层不加bFGF,鼠源性饲养层加4ng/ml bFGF),同期接种同一株hESCs,对比hESCs的贴壁率、克隆生长率及未分化率,比较它们支持hESCs生长的差异;通过酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,快速检测评估人源性和鼠源性饲养层细胞自身分泌的bFGF. 结果 人包皮和鼠源性饲养层培养hESCs的贴壁率和克隆生长率之间无显著差异(P＞0.05),但是鼠源性支持三代hESCs的未分化率均高于人源性饲养层(P＜0.05).鼠源性饲养层不能分泌任何可测量到的bFGF,而人源性饲养层细胞均能分泌bFGF. 结论 饲养层细胞自身分泌的bFGF能支持hESCs的贴壁和增殖生长,但不同饲养层支持hESCs生长的适宜bFGF浓度和抑制hESCs分化的作用机制,还有待于进一步研究.
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建立不同类型干细胞并比较其分泌细胞因子的水平
目的 比较不同类型干细胞分泌细胞因子的水平,探讨其潜在的临床意义. 方法 建立人类胚胎干细胞(hESCs)、脐带间充质干细胞(UMSCs)、羊膜间充质干细胞(AMSCs)株系;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析干细胞分泌细胞因子水平:(1)促炎因子,包括白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子(TNF-α);(2)抑炎因子白细胞介素-10(IL-10);(3)生长因子,包括肝细胞生长因子(HGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、干细胞因子(SCF)和血管内皮生长因子(VEGF);(4)基质金属蛋白酶MMP-1及其抑制剂TIMP-1;(5)血管形成因子(Angiogenin),白血病抑制因子(LIF)以及骨形成蛋白(BMP4). 结果 女性UMSCs分泌生长因子、血管生成因子、造血因子、抑炎因子等的能力显著强于hESCs、AMSCs(P＜0.05);女性hESCs、男性UMSCs分泌金属蛋白酶的水平显著高于其它干细胞(P＜0.05). 结论 女性UMSCs可能具有更好的促进细胞生长、改善血供的能力;而女性hESCs、男性UMSCs则可能具有更强的降解结缔组织的能力.
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浅析我国人胚胎干细胞发明的可专利性
本文对人胚胎干细胞发明在我国专利制度下的可专利性进行分析.目前,我国专利制度与欧洲专利制度相似,对于发明是否能被授予专利权都添加了道德因素的考量.通过比较中国与西方对"胚胎是否等同于人"的观念、国家对人胚胎干细胞研究的立场、<人胚胎干细胞研究伦理指导原则>在相关研究中的作用等,说明以违反社会公德为由一概否定人胚胎干细胞发明的可专利性略显武断.基于我国专利法的立法目的 以及TRIPs 协议中对公众健康予以保护的规定,笔者认为应进一步完善我国专利制度并以是否具有全能性为界限对人胚胎干细胞发明的可专利性予以区分处理.
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胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展
近年来,不断有研究证明人胚胎干细胞(hESC)的多能性,以及小鼠胚胎干细胞(mESC)能够分化为早期配子并形成囊胚样结构[1,2].2003年5月,Hubner等[1]研究发现,小鼠胚胎干细胞在体外可分化为卵母细胞.Nayernia等[3]研究发现,mESC可于体外分化为未成熟的精子,并且成功获得了存活的后代.这些研究对发展新的生殖工程学提供了开创性思路,研究胚胎干细胞向生殖细胞的分化将为人类生殖细胞的发育机制带来新认识,并为不孕不育症的治疗提供一种崭新的思路和方法.
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冷冻胚胎经序贯共培养用于建立人胚胎干细胞系
目的:利用长期冷冻人卵裂期胚胎经序贯共培养形成的囊胚建立人类胚胎干细胞系.方法:将冷冻≥10年的卵裂期胚胎复苏后,采用单层卵丘细胞序贯共培养至囊胚期,经辅助孵出,置鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层全胚培养,原代培养6d后加入20％ MEF条件培养基培养至形成原代克隆.观察人胚胎干细胞集落的生长状态并通过碱性磷酸酶染色、Oct-4基因表达、核型分析及体外分化实验等方法进行生物学鉴定.结果:9枚冷冻卵裂期胚胎经序贯共培养,有6枚发育到囊胚期,终获得1株胚胎干细胞系.经鉴定该细胞系具有碱性磷酸酶活性、表达Oct-4胚胎干细胞特异标记、形成拟胚体、在体外形成具有自动节律性的心肌细胞、并具有46,XY核型等5种特性.结论:冷冻胚胎经序贯共培养能够改善胚胎发育潜能,有助于建立人胚胎干细胞系.
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人胚胎干细胞研究的现状与前景
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎的内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCS)分离出来的多潜能细胞系.它具有与早期囊胚ICM或PGCs相似的生物学特性,在体外能够保持正常二倍体核型和未分化状态,并且有多方向分化潜能.在适当条件下,ES细胞可被诱导分化为多种细胞、组织,也可以与受体胚胎嵌合,形成嵌合体.1998年,美国威斯康星大学Thomson等[1]率先成功分离、克隆了人胚胎干细胞,并建立了细胞系,这一研究成果立刻在国际上引起轰动,成为世界关注的焦点.由于人ES细胞具有其它哺乳动物ES细胞的一般特性,能够在适宜条件下分化成构成人体的任何一种组织.因此,人ES细胞能够为组织工程研究提供可靠的细胞来源,同时能够在人早期胚胎发生、细胞组织分化以及基因调控等研究领域发挥重要作用.基于此,笔者针对人胚胎干细胞的研究进展及其应用前景做一简要回顾[1-10].
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BDE-209/BPA暴露对人胚胎干细胞系FY-hES-10早期神经分化中印记基因表达的影响
目的 探讨十溴联苯醚(BDE-209)和双酚A(BPA)暴露对人胚胎干细胞系FY-hES-10体外早期神经分化中印记基因表达的影响.方法 利用添加小分子抑制剂的方法将FY-hES-10细胞系进行神经贴壁诱导,并在培养基中添加低剂量的BDE-209或/和BPA,每24 h换液1次,连续暴露11 d.收集诱导分化第11天的细胞检测nestin阳性率以及印记基因SNRPN、KCNK9、UBE3A和PEG10的表达水平.结果 BDE-209、BPA单独或联合暴露组nestin的阳性率明显低于对照组(P<0.05).印记基因SNRPN、KCNK9、UBE3A在BDE-209、BPA单独或联合暴露组表达均明显低于对照组,PEG10在BDE-2091 nmol/L和BDE-2091 nmol/L+BPA 1 nmol/L组表达明显低于对照组,而在BPA 1 nmol/L组中表达与对照组无明显区别.结论 低剂量BDE-209/BPA单独或联合暴露均有可能通过影响胚胎干细胞早期神经分化中印记基因表达从而产生神经发育毒性,BDE-209和BPA联合暴露可能加重神经发育毒性.
关键词： 十溴联苯醚(BDE-209) 双酚A(BPA) 人胚胎干细胞 神经分化 印记基因 -
OCT4异构体在人胚胎干细胞和间充质干细胞中的表达
目的 比较OCT4异构体(OCT4A、OCT4 B、OCT4 B1)及其调控因子在人胚胎干细胞(hESC)和人间充质干细胞(hMSC)中的表达.方法 利用RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞分析及体内/外分化实验,鉴定hESC及hMSC的生物学特性;应用real-time PCR、Western blot和流式细胞分析比较OCT4异构体及其转录因子NANOG,SOX2和mRNA结合蛋白LIN28在hESC及hMSC中的表达水平.结果 OCT4异构体mRNA在hESC和hMSC中均有表达,在hESC中的表达显著高于在hMSC中,并以OCT4A的差别为显著(P＜0.01);在蛋白水平,hESC表达OCT4A和OCT4B-256aa,hMSC不表达OCT4异构体蛋白.hESC高表达OCT4的调控因子NANOG、SOX2和LIN28;hMSC低表达SOX2,不表达NANOG和LIN28.结论 NANOG、SOX2和LIN28调控OCT4的表达,OCT4异构体在hESC和hMSC中的表达差异提示其可能是不同发育阶段于细胞自我更新和分化潜能等方面差别的主要因素之一.
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FGFR2异构体及相关剪接因子在人胚胎干细胞和成体干细胞中的表达
目的 比较FGFR2异构体及其剪接因子在人胚胎干细胞(hESCs)及其分化的拟胚体(EBs),以及骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和毛囊干细胞(HFSCs)等不同组织来源成体干细胞(ASCs)中的表达.方法 用RT-PCR、免疫荧光染色和流式细胞仪分析鉴定hESCs、EBs和ASCs的生物学特性;用real-time PCR比较FGFR2异构体Ⅲb、Ⅲc及相关剪接因子的表达.结果 FGFR2的选择性剪接在hESCs、EBs和ASCs中均以Ⅲc为主.hESCs向EBs分化后,Ⅲb和Ⅲc的表达及Ⅲb/Ⅲc比值均升高,EBs中抑制Ⅲc表达的剪接因子FOX2和抑制Ⅲb表达的剪接因子HnRNPA1分别在分化第7天和第14天表达升高(P＜0.05).FGFR2异构体在hESCs与HFSCs中的表达水平显著高于在BMSCs和ADSCs中(P＜0.01),在BMSCs中的表达水平显著高于在ADSCs中(P＜0.05).多种FGFR2相关剪接因子在hESCs和HFSCs中的表达水平显著高于在BMSCs和ADSCs中(P＜0.05).结论 FGFR2异构体及其相关剪接因子在不同分化阶段和组织来源的干细胞中有不同的表达谱.
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人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立
目的 拟建立人胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系.方法 将干细胞分别置于Knockout培养基(第1组)、自制无血清培养基(第2组)和添加bFGF及肝素的改良无血清培养基(第3组)中培养25代后观察比较3组干细胞形态学变化、克隆数目及大小.并借助细胞免疫组化、流式细胞术和体外拟胚体形成等方法检测干细胞的未分化状态和全能性.结果 传代25次后,第2组克隆逐渐分化.第1组和第3组的干细胞均呈典型的人胚胎干细胞形态特征；细胞表达Nanog,Oct-4,Tra-1-60,SSEA-4,但不表达SSEA-1；流式检测也显示SSEA-4高表达,SSEA-1低表达；体外分化能形成拟胚体.通过单位视野下克隆个数及大小的比较,结果显示第2组与第1组和第3组间的差异显著.结论 本研究通过改良本实验室已获得国家专利的无血清培养基,初步建立了人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系,培养效果与公认培养体系无明显差异.
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慢病毒介导绿色荧光蛋白转染人胚胎干细胞及其培养
目的 稳定培养人胚胎干细胞,并通过慢病毒载体对其进行绿色荧光蛋白标记.方法 利用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层或Matrigel作为基质培养人胚胎干细胞,包装带有GFP序列的慢病毒转染人胚胎干细胞.对转染前后的人胚胎干细胞进行了碱性磷酸酶和SSEA-3免疫组化鉴定.结果 在MEF饲养层和Matrigel上均可培养出呈克隆样生长,表达标志抗原的人胚胎干细胞,经慢病毒转染及抗生素筛选后仍可稳定表达GFP.结论 成功地培养了人胚胎干细胞系,并进行了GFP标记.
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人胚胎干细胞原代克隆生长及其传代的研究
目的评价人胚胎干细胞建系与囊胚质量、原代克隆生长的关系. 方法 D3废弃胚胎成组共培养获得不同质量的囊胚,免疫刀去除囊胚滋养外胚层细胞后,将内细胞团(ICM)接种到饲养细胞层上生长、传代. 结果从质量好的囊胚得到的人胚胎干细胞传代的代数更多;原代克隆生长快的人胚胎干细胞传代效率更高. 结论人胚胎干细胞建系与囊胚质量、原代克隆生长情况密切相关.
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干细胞体外自发分化和相关基因表达状况的研究
目的 在人胚胎干细胞(hESC)体外自发分化过程中,检测子宫内膜发育相关基因的表达以及子宫内膜样组织结构,子宫内膜样细胞的存在.方法 悬浮法培养类胚体14 d,10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋切片,取具有子宫内膜样组织结构的切片行雌激素受体(ER)免疫组织化学染色.hESC贴壁分化10 d,免疫荧光双标检测雌激素受体/波形蛋白(角蛋白)的表达.hESC贴壁分化5 d,RT-PCR方法检测子宫内膜发育相关基因:Wnt4、Wnt7a、Wnt5a、Hoxa10、Hoxa11、ER的表达.结果 hESC贴壁分化5 d后可检测到Wnt4、Wnt7a、Wnt5a、Hoxa10、Hoxa11、ER的表达.hESC贴壁分化10 d后,部分细胞同时表达ER/波形蛋白(角蛋白).培养14 d类胚体内存在子宫内膜样的腺体结构,部分腺体结构ER表达阳性.结论 hESC自发分化过程中,可能部分细胞具有自发分化为子宫内膜干细胞,子宫内膜细胞的倾向,但需对整个发育过程进行进一步鉴定.
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人胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展
小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为配子细胞,人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能.本文从影响人胚胎干细胞体外向生殖系分化的基因调控和干细胞小生境(niche)方面进行综述,并指出胚胎干细胞在生殖医学及不孕治疗中的研究方向和应用前景.
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基于测序的人类白细胞抗原分型和PCR短串联重复序列技术在人胚胎干细胞鉴定中的应用
目的 探讨基于测序的人类白细胞抗原分型(HLA-sequencing-based typing,HLA-SBT)和PCR短串联重复序列(short tandem repeat,STR)技术在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)应用前检测中的运用,建立人胚胎干细胞系的基因型档案.方法 人胚胎干细胞系SYSU-I、SYSU-3,分别培养到20代、40代,应用PCR寡核苷酸特异测序探针(sequence specific olignucleotide probe,SSO)技术检测两株细胞系的HLA-A、-B、-DR位点的低分辨分型,再利用HLA-SBT技术检测两株细胞系的HLA-A、-B、-DR位点的高分辨分型.应用PCR-STR技术检测两株细胞系的基因遗传标记.结果 获得两株hESC细胞系的HLA高分辨分型和STR基因型.结论 可以运用HLA-SBT和PCR-STR技术建立人胚胎干细胞应用前的基因型档案.
关键词： 基于测序的人类白细胞抗原分型 短串联重复序列 人胚胎干细胞 -
人胚胎干细胞培养与诱导分化的研究进展及其存在问题
人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)指来源于人胚胎的具有无限自我增殖能力和多向分化潜能的细胞,主要由人囊胚内细胞群(inner cell mass,ICM)分离得到.由于胚胎干细胞具有高度自我复制能力及多向分化潜能,可被应用于生命科学的多个领域.本文就人胚胎干细胞培养条件、体外诱导分化技术作一综述.
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通用型红细胞工程的研究进展
生产、使用O型通用型红细胞(universal red blood cells)是未来输血医学发展的方向,本文综述了近年制备通用型红细胞的技术.第1种是红细胞血型抗原修饰技术,又分为2种方法:①糖苷酶酶解法,利用特异的外切糖苷水解酶将红细胞表面的A、B抗原的糖基去除,制备酶解转变的O型红细胞(ECO-RBC);B型红细胞制备的ECO-RBC已经成功地进行了临床输血试验,可安全地输给A型和O型患者;由于A抗原结构的复杂性,A型红细胞的酶解转变研究存在很大困难,目前应用细菌来源的新型糖苷酶同时实现了A1→0、A2→O的转变;②PEG化技术,利用化学材料甲氧基聚乙二醇(mPEG)非特异地遮蔽红细胞表面抗原,制备O型及表面稀有血型抗原阴性的通用型红细胞.第2种是诱导多能干细胞或成体细胞分化为成熟的红细胞的技术,不仅可制备ORh-型红细胞,还可作为新的血液来源以解决目前的血源短缺问题.目前,可用来诱导产生红细胞体系的启动细胞有造血干细胞(HSC),诱导性多能干细胞(iPSC)和人胚胎干细胞(hESC)或真皮成纤维细胞(Fib);利用多能干细胞制备通用型红细胞尚处于实验研究阶段,其生产工艺、生产成本及生产的红细胞的安全性、有效性距离临床应用还有许多问题有待解决.尽管如此,这些研究结果对防止血荒或血液传染性疾病的发生,保障应急用血,提高临床输血安全具有重要意义.
关键词： 通用型红细胞工程 酶解转变的通用型红细胞 多能干细胞 人胚胎干细胞 成纤维细胞 -
BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作用研究
目的:探讨BET bromodomain蛋白在人胚胎干细胞造血分化中的作用.方法:应用人胚胎干细胞单层造血分化体系,通过免疫荧光技术、流式细胞术及实时定量PCR技术,研究BET bromodomain蛋白抑制剂I-BET151对造血分化的影响,并在不同分化阶段添加I-BET 151探讨其在造血分化过程中的作用阶段.结果:I-BET151能够显著抑制CD43+造血干/祖细胞的产生,并且在APLNR+侧板中胚层生成、CD34+ CD31+生血内皮产生及内皮细胞生血转化3个阶段添加I-BET 151对CD43+造血干/祖细胞的产生均有显著抑制作用.结论:人胚胎干细胞造血分化过程中添加BET bromodomain蛋白抑制剂I-BET 151,能够抑制CD43+造血干/祖细胞的产生,并进一步证实BET bromodomain蛋白在造血分化各个阶段均发挥有作用.
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microRNA-223调控人胚胎干细胞向树突细胞分化
目的:建立人胚胎干细胞(ESC)向树突细胞诱导分化的新策略,探讨microRNA-223(miR-223)在人胚胎干细胞源树突细胞产生过程中的调控作用及其分子机制.方法:采用人胚胎干细胞在胞外基质Ⅳ型胶原蛋白上直接贴壁培养,加入造血生长因子分步向造血干/祖细胞、共同髓系祖细胞和树突细胞诱导的方案,通过形态学、流式细胞术和造血集落形成实验鉴定分化细胞;人胚胎干细胞经慢病毒转染过表达miR-223或抑制其表达后启动向树突细胞分化,比较不同miR-223表达水平下分化细胞中造血集落形成的数目和表面标记物的表达量;应用双荧光素酶报告基因检测验证TGFBR3是miR-223发挥作用的直接靶标.结果:人ES细胞成功诱导为树突细胞,分化细胞中表达CD83比例可达82％,在整个分化过程中miR-223表达呈上调趋势;添加miR-223模拟物组分化细胞表达CD34+ CD45+、CD34+ CD45+以及CD83+的比例均显著高于添加miR-223抑制剂组和阴性对照组(P＜0.05);添加miR-223抑制剂组分化细胞表达各阶段细胞标记物显著低于阴性对照组(P ＜0.05);添加miR-223模拟物组分化细胞出现大约759个CFU/105细胞数,显著高于其它各组(P＜0.05);双荧光素酶报告基因结果显示,miR-223显著抑制TGFBR3-3'UTR结构的荧光素酶活性(下降了37％)(P＜0.05),而且TGFBR3-3'UTR突变型的荧光素酶活性显著高于野生型(P＜0.01);随着向树突细胞分化成熟,添加miR-223模拟物组分化细胞表达TGFBR3水平逐渐下降,而添加miR-223抑制剂组由于内源性miR-223受到抑制而明显上调TGFBR3的表达.结论:miR-223调控人胚胎干细胞向树突细胞分化,可能通过直接作用于靶标TGFBR3而促进胚胎干细胞源树突细胞的产生.
关键词： 人胚胎干细胞 树突细胞 MicroRNA-223 诱导分化 TGFBR3
