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干细胞体外自发分化和相关基因表达状况的研究
目的 在人胚胎干细胞(hESC)体外自发分化过程中,检测子宫内膜发育相关基因的表达以及子宫内膜样组织结构,子宫内膜样细胞的存在.方法 悬浮法培养类胚体14 d,10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋切片,取具有子宫内膜样组织结构的切片行雌激素受体(ER)免疫组织化学染色.hESC贴壁分化10 d,免疫荧光双标检测雌激素受体/波形蛋白(角蛋白)的表达.hESC贴壁分化5 d,RT-PCR方法检测子宫内膜发育相关基因:Wnt4、Wnt7a、Wnt5a、Hoxa10、Hoxa11、ER的表达.结果 hESC贴壁分化5 d后可检测到Wnt4、Wnt7a、Wnt5a、Hoxa10、Hoxa11、ER的表达.hESC贴壁分化10 d后,部分细胞同时表达ER/波形蛋白(角蛋白).培养14 d类胚体内存在子宫内膜样的腺体结构,部分腺体结构ER表达阳性.结论 hESC自发分化过程中,可能部分细胞具有自发分化为子宫内膜干细胞,子宫内膜细胞的倾向,但需对整个发育过程进行进一步鉴定.
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以小鼠子宫内膜干细胞为种子细胞构建工程化子宫内膜用于小鼠子宫内膜损伤修复的研究
目的 以小鼠子宫内膜干细胞为种子细胞构建工程化子宫内膜在小鼠子宫内膜损伤修复中的应用价值.方法 选择SPF级昆明小鼠,分离子宫内膜干细胞并进行流式细胞仪分选检测;建立小鼠子宫内膜损伤模型,并在损伤后进行子宫内膜干细胞移植治疗、模型组织形态学表现与免疫组化分析.结果 子宫内膜干细胞传代培养后生长状态好,呈梭形贴壁生长,分选的干细胞细胞占总细胞数的2.17%左右.子宫内膜损伤部位可见大量有核细胞的聚集,失去了正常的上皮及腺体结构,组织间隙水肿.子宫内膜干细胞移植治疗14 d后子宫内膜能够发现生成有新的上皮细胞和基质细胞,对正常自动内膜以及侧子共内膜细胞的结构没有显著区别.病灶标本HE染色异位病灶呈囊状,囊壁由多层细胞构成,囊壁外覆盖纤维结缔组织.结论 小鼠子宫内膜组织中干细胞的比例为2.17%左右,采用100℃生理盐水处理可以构建小鼠子宫内膜损伤模型,此种移植子宫内膜干细胞的方法对于子宫内膜损伤的修复具有一定帮助.
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活血化瘀法对子宫内膜异位症子宫内膜干细胞的影响
[目的]研究活血化瘀组方姜黄散对子宫内膜干细胞的影响.[方法]噻唑蓝(MTT)法明确姜黄散及孕三烯酮对人子宫内膜干细胞体外干预的高无毒浓度及作用时效.对比孕三烯酮阳性对照组及不加药阴性对照组评价姜黄散对子宫内膜干细胞克隆形成、微球体形成能力的影响.将子宫内膜干细胞接种于裸鼠皮下形成异位病灶后予药物干预,对比孕三烯酮阳性对照组及不加药阴性对照组观察姜黄散高、中、低剂量组异位病灶体积及异位腺体数量的变化.[结果]姜黄散及孕三烯酮对子宫内膜干细胞干预的高无毒浓度分别为20 mg/mL及10-6 mol/L,且其抑制作用随时间延长而加强.与阴性对照组比较,姜黄散及孕三烯酮可明显抑制子宫内膜干细胞的克隆形成及微球体形成能力.姜黄散高、中剂量及孕三烯酮可明显抑制裸鼠异位病的生长,异位病灶体积及异位腺体数量较给药前均明显减小.[结论]活血化瘀法具有抑制子宫内膜干细胞增殖的作用.
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人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞的分化
背景：蜕膜组织是重要的子宫内膜干细胞来源之一，从蜕膜组织中可分离出间充质干细胞。通过对其进行一定的诱导，可分化为不同的细胞类型。
目的：从人早孕蜕膜组织中分离得到子宫内膜间质干细胞，对其进行诱导分化，观察其向子宫内膜上皮细胞分化的情况。
方法：获得人早孕蜕膜组织，进行子宫内膜间质干细胞分离培养和鉴定。对子宫内膜间质干细胞进行定向分化诱，进行实验分组，分别为实验组(子宫内膜条件培养液)和对照组(含胎牛血清的正常培养基)，利用免疫荧光法检测角蛋白表达情况。并进行Western bolt检测，检测实验组与对照组细胞的角蛋白相对表达量。
结果与结论：①从人早孕蜕膜组织中成功分离培养获得子宫内膜间质干细胞，细胞体外生长曲线呈“S”形，接种后1-48 h，曲线平缓上升，细胞处于适应期。接种48 h之后，曲线陡峭上升，细胞增殖速度加快，进入对数期；接种60 h之后，细胞生长速度下降，曲线平稳上升；②经流式细胞仪检测，子宫内膜间质干细胞可以表达CD73、CD90，不表达CD34、CD45、细胞角蛋白；③经免疫荧光检测，角蛋白表达方面，对照组不表达，实验组大部分细胞均呈阳性表达；④经Western bolt检测，实验组细胞的角蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)；⑤实验结果表明，从人早孕蜕膜组织中可以分离获得子宫内膜间质干细胞，通过对细胞进行定向诱导，可以使其向子宫内膜上皮细胞发生分化。 -
子宫内膜异位症病因学研究进展
子宫内膜异位症(endometriosis,简称内异症)因发生部位及病程不同而临床表现多种多样,病理组织学上虽然是良性的,却有增生、浸润、转移及高复发率等恶性行为.因此,对该病的彻底治疗及预防复发一直是困扰妇科领域的难题.
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子宫腺肌病发病机制研究进展
子宫腺肌病是一种常见的雌激素依赖性妇科疾病,可引起盆腔疼痛、子宫异常出血和不孕.但其发病机制和病因尚不明确,本研究就子宫腺肌病的起因及疾病的演变和进展的机制进行综述.1雌激素过多类固醇激素在子宫腺肌病的病因中起着核心作用.子宫腺肌病患者的异位或者在位子宫内膜的分泌活动,导致了超生理的雌激素水平,可能会导致疾病的发生.与外周血水平相比,子宫腺肌病患者月经血中E2水平升高,支持了这一观点[1].
关键词： 雌激素过多 子宫内膜损伤修复机制 苗勒氏管残留 子宫内膜干细胞 上皮间充质转化 -
补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠子宫内膜干细胞 标志物的影响
目的 探讨补肾活血中药对薄型子宫内膜大鼠子宫内膜干细胞标志物的影响.方法 取处于动情期的雌性大鼠36只随机分为正常对照组、模型组、补佳乐组以及补肾活血中药高、中、低剂量组.除正常对照组外,其余各组大鼠建立肾虚血瘀薄型子宫内膜模型.正常对照组灌服蒸馏水,模型组建立模型后灌服蒸馏水,补佳乐组建立模型后灌服补佳乐0.3 mg/(kg·d),补肾活血中药高、中、低剂量组建立模型后分别灌服补肾活血中药8.64、4.32、2.16 mg/kg.经过3个动情周期后,处死大鼠,取材.免疫组织化学检测活化β-catenin蛋白的表达、RT-PRC检测Oct4基因表达以及Wertern blot法检测ABCG2蛋白的表达.结果 1)活化β-catenin蛋白的表达:模型组较对照组极显著降低(P<0.001),给药后各组β-catenin不同程度增加,低剂量组较模型组有显著性差异(P<0.05),中剂量组、高剂量组、补佳乐组与模型组有极显著性差异(P<0.001).2)Oct4基因的表达:模型组较对照组极显著降低(P<0.001),给药后各组OCT4表达量不同程度增加,其中低剂量、中剂量与模型组无显著性差异,高剂量与模型组有极显著性差异(P<0.001),补佳乐组与模型组有显著性差异(P<0.05).3)ABCG2蛋白的表达:模型组较对照组极显著降低(P<0.001),给药后各组ABCG2表达量不同程度增加,其中低剂量与模型组无显著性差异,中剂量组与模型组有显著性差异(P<0.05),高剂量、补佳乐组与模型组有极显著性差异(P<0.001).结论 补肾活血中药可以不同程度的增加β-catenin蛋白、OCT4基因及ABCG2蛋白的表达.
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人蜕膜组织子宫内膜干细胞的分离、培养及鉴定
目的:研究人蜕膜组织中子宫内膜干细胞(endometrial stem cells,EnSCs)的分离、培养及鉴定方法.方法:取人工流产患者的蜕膜组织,用胰酶和Ⅱ型胶原酶消化分离子宫内膜细胞,计数后,以极低密度接种于10 cm培养皿,分离单克隆贴壁细胞.倒置显微镜观察EnSCs形态变化及克隆形成情况;CCK-8法绘制EnSCs生长曲线,计算倍增时间;流式细胞仪分析EnSCs细胞周期及表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146表达情况.结果:EnSCs呈长梭形,成纤维细胞样,可见粗细不等的胞质突起,增殖至80-90％呈漩涡状生长,其克隆形成率分别为3.91％和9.14 ％;EnSCs生长曲线呈“S”型,接种48 h至60h后进入对数生长期,于第9天达到平台期,倍增时间为37-52h;流式细胞仪测定EnSCs表面抗原CD29 (99.13％),CD44(97.39％),CD73 (99.68％),CD90(96.76％),CD105 (89.64％),CD146 (77.96％)呈阳性表达,而CD31 (1.30％),CD34(0.68％),CD45(1.26％)呈阴性表达,有61.79％的细胞处于G0/G1期,22.37％的细胞处于S+G2/M期.结论:采用组织消化法分离单克隆贴壁的子宫内膜细胞,能够获得纯化的EnSCs.
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Importin13在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及意义
背景与目的:正常情况下的子宫内膜干/祖细胞有助于子宫内膜的生理性修复,而子宫内膜干/祖细胞的异常增殖和异常分化则会导致子宫内膜疾病(如子宫内膜异位症和子宫内膜癌).Importin 13 (IP013)是importin β家族新成员的一个核质双向的转运受体蛋白,是角膜上皮干细胞的一个标记,在维持干细胞的性状、高增殖潜力、低分化状态,调节细胞分化以及小鼠生殖细胞减数分裂上具有重要的作用.本文探讨成体干细胞标记IP013在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及意义.方法:手术取正常子宫内膜组织40例(对照组),其中增生期和分泌期各20例,异位子宫内膜组织20例(异位症组)和子宫内膜癌病灶组织20例(内膜癌组).采用免疫组化SP法检测IP013蛋白在细胞内的定位；采用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitativepolymerase chain reaction,RT-PCR)检测IP013 mRNA的表达；Western blot检测IP013蛋白的表达.结果:IP013蛋白在内膜癌、异位症及正常对照组中腺上皮细胞和间质细胞的细胞质和细胞核中均有表达.IP013蛋白在对照组增生期表达量(0.52±0.30)明显高于分泌期(0.25±0.04,P＜0.05)；IP013蛋白在异位症组表达量(0.81±0.12)明显高于对照组增生期及分泌期(P＜0.05)；IP013蛋白在内膜癌组表达量(1.21±0.11)明显高于异位症组(P＜0.05).IP013 mRNA在对照组增生期表达量是分泌期的3倍(P＜0.05); IP013 mRNA在异位症组中表达量是对照组分泌期的6倍(P＜0.05),增生期的2.5倍(P＜0.05); IP013 mRNA在内膜癌组表达量是异位症组的2倍(P＜0.05).结论:IP013在子宫内膜癌中及异位症组中表达明显高于对照组,推测其高表达与子宫内膜癌及子宫内膜异位症发病密切相关.
关键词： 子宫内膜异位症 子宫内膜癌 Importin 13 子宫内膜干细胞 -
经血源子宫内膜干细胞复合3D打印PLGA支架体外培养的相容性研究
[目的]通过经血源子宫内膜干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs）与3D打印PLGA支架材料的复合培养，探讨构建组织工程化骨软骨的可行性。[方法]预处理3D打印PLGA支架，取第5代MenSCs，倒置显微镜下观察细胞生物学特性，按1.0×106/mL的密度接种到PLGA支架材料上复合培养，通过倒置显微镜、Mico-CT、扫描电镜和组织病理学进行观察，并借此判断MenSCs与3D打印PLGA支架材料复合体外培养的融合性。[结果] MenSCs生长良好，细胞平铺生长，呈梭形或纺锤形，胞质薄，核圆居中,具有成纤维细胞形态。细胞传至第5代，为长梭形细胞单层，呈漩涡状排列。PLGA支架的微观呈现相互连通的多孔结构，结构疏松，孔隙大且互相交通，孔壁较薄。MenSCs在PLGA支架材料上生长状态良好，细胞在支架表面和内部生长，支架孔径内有细胞基质样组织连接，表明MenSCs与3D打印PLGA支架材料复合体外培养的融合性良好。[结论]经血源MenSCs是骨组织工程适宜的种子细胞，与3D打印的PLGA支架材料复合可体外构建组织工程骨。
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体外分离子宫内膜干细胞3种方法的比较
目的:探索简便、实用、高效的体外分离、培养人子宫内膜干细胞的方法.方法:采用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和混合法3种体外细胞分离方法分离子宫内膜干细胞,并采用相同的方法进行培养.倒置显微镜下观察细胞消化、贴壁时间,纯化情况和细胞生长形态.绘制第2代细胞生长曲线.采用免疫细胞化学法检测第2代细胞CD90和CD146蛋白的表达,采用RT-PCR法检测CD90和CD146 mRNA的表达.结果:胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞具有操作简便,获得细胞纯度高,细胞易于贴壁,生长良好的优势.胶原酶Ⅰ法分离的细胞经培养后获得的细胞符合正常人子宫内膜干细胞形态学特征和生物学特征;第2代细胞生长曲线均为近似的"S"形;第2代细胞CD90和CD146蛋白的表达为阳性,CD90和CD146 mRNA有表达.结论:胶原酶Ⅰ法较为简便、实用并具有较高的成功率,是一种培养子宫内膜干细胞的可行性方法.
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人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究
目的:探讨早孕蜕膜组织分离子宫内膜间质干细胞及子宫内膜间质干细胞向子宫内膜分化的方法.方法:胶原酶Ⅰ法消化早孕人流子宫蜕膜组织,贴壁法分离子宫内膜间质干细胞,传代纯化至第2代,流式细胞仪检测其表面抗原.细胞免疫组织化学法检测角蛋白(CK)、波形蛋白(VIM)的表达.取第2代细胞,接种于24孔培养板爬片.实验分两组:单纯培养基组,细胞因子组即分别加入质量浓度均为10 ng/mL TGF-[3、EGF与PDGF-BB.培养至第6天,采用免疫细胞化学法检测子宫内膜上皮标记物CK18和间质标记物VIM的表达.结果:胶原酶Ⅰ酶消化后贴壁培养法能稳定从人早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞;子宫内膜间质干细胞不表达CD34、CD45、CK,强表达CD73、CD90、HLA-Ⅰ;细胞免疫化学法检测干细胞CK阴性,VIM阳性.细胞免疫化学染色提示生长因子组CK阳性,VIM阳性,而对照组CK阴性,VIM阳性.结论:胶原酶法能有效从早孕蜕膜组织中分离出子宫内膜间质干细胞,且子宫内膜间质干细胞能向子宫内膜上皮细胞分化.
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miR-96靶向血管生成素-1基因对子宫内膜异位症子宫内膜干细胞增殖的影响
目的 研究miR-96靶向血管生成素-1(Ang-1)基因对子宫内膜异位症(EM)子宫内膜干细胞(EnSCs)增殖的调控作用.方法 分离培养EM患者EnSCs,流式细胞仪检测EnSCs表面标志物,RT-PCR检测EnSCs中miR-96和Ang-1的表达,Western blot检测Ang-1蛋白表达水平,miR-96 inhibitor转染EnSCs后,RT-PCR和Western blot检测miR-96、Ang-1和蛋白的表达,双荧光素酶报告基因检测miR-96与Ang-1的相互作用,MTT细胞增殖实验检测miR-96对EnSCs增殖的影响.结果 EnSCs表达CD140b和CD146,不表达CD31和CD34;EM患者EnSCs中miR-96和Ang-1的表达均较非EM明显升高(P<0.01),且两者的变化具有正相关性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs中miR-96和Ang-1表达降低;miR-96能与Ang-1的3′UTR特异性结合,调控Ang-1的表达活性;转染miR-96 inhibitor可使EnSCs的增殖能力下降.结论 miR-96通过靶向Ang-1促进EnSCs的增殖,可能在EM的发病过程中发挥作用.
