首页 > 文献资料
-
人胚胎干细胞向成纤维细胞分化方法的专家共识
人胚胎干细胞（ESC）是一类从囊胚期的人胚胎内细胞团中分离所得的，具有体外自我更新稳定性并维持正常核型和发育多能性，甚至参与整个个体发育的高度未分化干细胞［1］。利用人ESC或由其分化而成的人体细胞、组织或器官来测试各种生物医用材料、食品及药物对人体的毒理特性或药效，较运用动物或永生化细胞更能反映人体真实的状况。因此，人ESC及其分化的细胞有望发展成为一种崭新的生物安全性检测和药物筛选模型［2］。目前多数研究仍用永生化细胞系或原代培养细胞进行生物材料的安全性评价［3-4］，分别存在核型异常或批次差异大等缺点。人ESC来源的成纤维细胞（ ES-F ）具有来源稳定，核型正常以及容易标准化等优点［5-6］，有望成为生物安全性评价体系的新模型［7］。规范人ESC向成纤维细胞分化方法是保证生物安全性检测评价模型可靠性的关键。为此，科技部国际科技合作重点项目“创建基于人胚干细胞的预测健康安全新体系”的项目组专家经反复讨论，制定了“人胚胎干细胞向成纤维细胞分化方法的专家共识”（以下简称“共识”），旨在规范人ES-F的分化方法，提高人ES-F的纯度，保证分化方法的可重复性，使其更系统、规范和有效地应用于临床和生物安全性评价体系中。
-
第6届全国烧伤外科学术会议大会交流论文(摘要)
人胚胎干细胞的分离培养及应用前景(第三军医大学烧伤研究所罗向东) 干细胞数量极少,在组织细胞中只约占1/10万,在体外很容易失去原来的特性,所以干细胞的分离、保存并在体外人工大量培养,是干细胞研究的首要课题.干细胞具有以下特点:1.具有进一步分化的潜能;
-
胚胎干细胞和成体干细胞的鉴定
胚胎干细胞是一种具有在体外不分化的无限增殖能力，而在一定条件下又能分化为体内多种细胞类型的原始细胞。自1998年美国Thomson等建立人胚胎干细胞系以来，对人胚胎干细胞的建系及开发利用引起了国内外的高度重视。而人胚胎干细胞系的建立以及定向分化的成功与否必须通过鉴定来确定。现就胚胎干细胞和成体干细胞的鉴定如下综述。
-
人胚胎干细胞培养体系的研究进展
人胚胎干细胞(hES细胞)是来源于着床前人囊胚内细胞团的、具有自我更新能力和分化全能性的细胞.由于具有体外无限增殖和分化成三个胚层来源的各种细胞的潜能,hES细胞具有重要的科学意义和巨大的医学应用价值.目前,hES细胞常规体外培养技术多采用培养基与饲养层相结合的方法,但常规方法存在异源病原体污染的可能.近年来,优化hES细胞体外培养体系的研究取得较大进展,现就饲养层、无饲养层培养体系进行综述,分析目前在维持hES细胞未分化状态的优化培养研究中取得的新进展和存在的问题.
-
014供卵用于干细胞研究的相关问题
正如Hwang等在Science中所描述,利用体细胞核移植技术(SCNT)创建人胚胎干细胞(hESC)进一步认识到干细胞研究的前景,利用有严重疾病或残疾个体的细胞核和供卵者的卵细胞已创建了11个细胞系,这项工作引发了伦理和政策方面的问题.随着胚胎干细胞研究向国际化发展,必须强调这些问题.现着重讨论3个值得注意的方面:①对具有不同伦理标准的科学家的科学研究进行伦理监督.②保护供卵者.③避免不切实际的期望.
-
bFGF在人胚胎干细胞中自我更新的研究进展
人胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的独特生物学特性.维持人和小鼠胚胎干细胞增殖的生长因子不同,白血病抑制因子(UF)不能维持人胚胎干细胞的生长.目前已经确定了数种维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新的生长因子.其中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)信号系统是人胚胎干细胞自我更新中重要的调节因素之一.将从bFGF及其受体在人胚胎干细胞中的表达和作用的新进展进行综述.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 人胚胎干细胞 成纤维细胞因子受体 自我更新 -
人胚胎干细胞饲养层培养体系的研究进展
人胚胎干细胞(hES细胞)来源于着床前人囊胚内细胞团(ICM),由于具有体外无限增殖和分化成3个胚层来源的各种细胞的潜能,使其成为当今生命科学的研究热点.建立一个理想的hES细胞培养体系是利用它的前提.目前,常用的hES细胞的体外培养方式是将其培养在饲养层细胞上.迄今为止,已经有多种细胞用于hES细胞的体外培养.饲养层的存在不仅为hES细胞的生长繁殖提供了一个稳定的外环境,同时也维持了hES细胞无限增殖与分化的特性；然而衰老的、不合适的饲养层会对hES细胞产生负面影响.对不同来源的饲养层细胞作一综述,比较不同种类的饲养层细胞的优缺点,旨在为将来的研究提供借鉴.
-
三氯乙烯对人胚胎干细胞心肌分化的影响和机制
目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞心肌发育分化的影响.方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为模型,分化培养液中添加不同剂量的TGE(分别为处理组100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及DMSO(对照组).对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞进行检测,通过MTT法测定细胞的生存能力,统计有自主节律跳动的拟胚体的数量;流式细胞仪计数分析细胞分化比例;荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达;并应用基因芯片方法初步筛选检测三氯乙烯对心肌细胞钙离子通道相关的基因表达的影响.结果:TCE的三个浓度处理组均未显示细胞毒性,但高浓度组明显抑制向心肌细胞分化,能产生自主节律搏动的拟胚体比例显著降低,同时心肌特异性标记物cTnT表达随剂量的增加而显著降低.在具有自主节律性的拟胚体中,钙离子通路的相关基因表达受到影响.结论:推测TCE通过降低成熟心肌的比例,以及影响心肌细胞中钙离子通道相关基因表达来共同导致心脏发育异常.
-
慢病毒介导绿色荧光蛋白转染人胚胎干细胞的研究
1998年Thomson等[1]成功分离、建立了人胚胎干细胞(hESC)细胞系之后,有关hESC的研究得到迅猛发展.hESC的自我更新和分化过程涉及到多种相关基因表达的活化或抑制,而开展这方面的研究需要有效的转基因技术来完成.由于hESC的培养条件非常苛刻,外源基凶的转入通常较困难.常用的转基因方法如脂质体、电穿孔、磷酸钙共沉淀等不能有效地将外源基因转入hESC中.目前关于hESC的转基因研究报道较少,我们采用慢病毒(lentivirus)载体成功地将绿色荧光蛋白(EGFP)基凶转入hESC,建立了稳定表达EGFP的hESC细胞系.
-
胚胎干细胞及其应用前景
人类正常胚胎发育过程是按严格的时空程序进行一系列细胞之间、核质之间相互作用的结果.从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞,主要取决于哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活.细胞环境中的各种因子的类型和浓度则是基因选择性激活的重要因素.因此,细胞分化是部分基因选择性的被激活或差异性表达,从而控制转移性蛋白质的合成和排布的结果,从20世纪60年代开始,人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖,又具有胚胎细胞全能性或多能性的,并通过适当条件诱导分化为各种类型的分化细胞的实验模型.经过各国科学家40余年不懈的努力,从小鼠胚胎性癌细胞(embryomal carcinoma cell,简称EC细胞)到人胚胎干细胞(embryonic stem cell,简称ES细胞)和胚胎生殖细胞(embryonic germ cell,简称EG细胞)先后建系成功,对哺乳动物发育和细胞分化研究起着巨大的推动作用,特别是为临床细胞治疗和组织工程开辟了良好的前景[1～3].本文对其应用前景综述如下.
-
体外组织器官克隆
对于从事移植科学的人来说,激动人心的消息来自1998-11-06出版的Science上1篇开辟新时代的文章;人胚胎干细胞培养成功.如果说1997-11-06 Roslin研究所Wilmut宣布克隆羊Dolly的成功引起全球轩然大波的话,这篇报道来自人囊胚胎细胞团的胚胎干细胞系(embryonic stem cell lines)的科学进展更是石破天惊,有人认为其科学意义仅有70年代的重组DNA技术的发明才可与之相比[1].当期的Science配发了相应的文章,宣布一个伟大时代正向我们迅速走来[2～4].
-
人胚胎干细胞建系和分化研究进展
在建立人ES细胞系和发现人ES细胞能被诱导分化为特定细胞后,ES细胞的临床应用前景就更为广阔.本文对目前人胚胎干细胞建系和诱导分化研究进展及应用前景作一综述.
-
人细胞库研究进展
在许多研究和生物技术的应用中，一个关键的问题是获得具有特异性分化特性的来源丰富的人细胞供体源。近这方面取得的进展包括：①转染DNA肿瘤病毒基因;②外源性端粒酶表达或激活内源性端粒酶活性;③发展建立体外培养人胚胎干细胞的方法。
-
人胚胎干细胞的保存方法
目的:胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克降数减少,因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性.实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率,以及解冻后细胞生长与分化的状态.方法:实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成.①材料:清洁级孕13.5 d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供,用于制备鼠成纤维细胞饲养层,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供:kryo-550.16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成.②实验方法:将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上,胶原酶Ⅳ消化传代,分3组冷冻保存人胚胎干细胞.程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃～-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃～-30℃,每分钟降温0.3℃ 30℃～-150℃,每分钟降温10℃.降至-150℃时置液氮中保存.改良慢速冻存法:A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品,B管含人胚胎千细胞培养基和二甲亚砜,将60个团块置入A管,再将B管液体移入A管,混匀后-70℃过夜,第2天移入液氮中保存.传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1 h,-70℃过夜,第2天移入液氮长期保存.③实验评估:解冻后,将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收,比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度.鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性.结果:①复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义(x2=6.81～13.89,P＜0.01).②复制生长与克隆分化程度:解冻后第7天与传统慢速冻存组比较,程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大(t=7.36,P＜0.05:t=6.89,P＜0.05),且解冻后克隆不易分化(x2=20.47,P＜0.01:x2=9.69,P＜0.01).③生物学特性鉴定:程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常,人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1.81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%.结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性.②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的.
-
三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较
背景:人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性.以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态,但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题.目的:制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层,观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态.设计:多样本观察比较.单位:海南医学院附属医院生殖医学中心.材料:实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成.包皮来自于行包皮环切的儿童,由海南医学院附属医院泌尿外科提供,儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定.清洁级孕12.5～14.5 d的胎鼠11只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.方法:胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏,按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养,待生长汇合后冻存部分原代细胞,用丝裂霉素C处理2.0～3.0 h后,按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层.人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上.上述两种成纤维细胞分别计数后,按1∶0,3∶1,1∶1,1∶3,0∶1比例混合,然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内,即混合饲养层.观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态,并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测.撤除饲养层,观察人胚胎干细胞体外分化情况.主要观察指标:①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较.②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较.③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测.④体外分化实验.结果:①:生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满,而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实,其克隆形态显著好于其他两种饲养层.②:小鼠胚胎成纤维细胞:人包皮成纤维细胞按1∶1混合时,人胚胎干细胞显著堆积生长,克隆边缘清晰、隆起明显且饱满,按1:3混合时无明显变化,优于其余3种混合比例.③:碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性,分别在200～300 bp和300～400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带.④:能形成拟胚体,贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞.?＃结论:①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比,两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养,获得更佳的克隆形态.②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好.
-
人胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验
背景:体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞国内外已做了大量研究.然而,在国内对胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究只限于小鼠胚胎干细胞,还未见有将人胚胎干细胞诱导为心肌细胞的报道.目的:将人胚胎干细胞系H14诱导分化为心肌细胞.设计:体外人胚胎干细胞培养细胞,采用悬浮法让其形成拟胚体,在不同的分化时期观察出现有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达.单位:香港中文大学公共卫生学院何鸿燊防治传染病研究中心分子生物学实验室.材料:实验所用人胚胎干细胞株H14来源于美国威斯康星大学WiCell研究所并授权使用.方法:于2006-08/12在香港中文大学公共卫生学院何鸿燊防治传染病研究中心分子生物学实验室完成.采用悬浮法培养人胚胎干细胞株H14,让其形成拟胚体.4 d后,将拟胚体培养在包被有明胶的6孔培养板内(5～10个胚胎体/孔),让其自发分化为跳动的拟胚体,显微镜下观察有节律性收缩的拟胚体;然后采用反转录聚合酶链反应方法检测心肌特异性基因的表达.主要观察指标:不同的分化时期有节律性收缩的拟胚体的比率以及心肌特异性基因的表达.结果:拟胚体形成8 d后,大约有2%的拟胎体出现有节律性的收缩,随着时间的延长,产生收缩的拟胚体越多,到第16天,大约有10%的拟胚体出现节律性跳动,跳动频率为70～100次/min.反转录聚合酶链反应结果显示,有节律性收缩的拟胚体表达心肌特异性的转录因子GATA-4和Nkx2.5,心肌特异性基因IsI-1和α-MHC.结论:国内首次成功使人胚胎干细胞诱导分化为心肌细胞.
-
人胚胎干细胞Pten基因表达及PI3K/Akt/mTOR信号通路下游蛋白的磷酸化
背景:各种磷酸化蛋白质表达水平对人胚胎干细胞维持未分化状态或定向分化的影响逐渐成为人胚胎干细胞的研究热点,研究发现磷酸化蛋白质表达水平可能决定着人胚胎干细胞的命运.目的:对PI3K/Akt途径下游的关键蛋白磷酸化水平进行检测,寻找PI3K/Akt途径中能够维持人胚胎干细胞未分化状态的下游蛋白.方法:用胎鼠成纤维细胞作为饲养层,二维培养的方法培养人胚胎干细胞,胶原酶消化后待测;以饲养层细胞、K562细胞株为对照.观察人胚胎干细胞生长状态;RT-PCR检测Pten基因表达;Western Blot检测p-PTEN、p-mTOR、p-P70S6K、p-4E-BP1 4种蛋白的表达.结果与结论:人胚胎干细胞在未分化状态时Pten mRNA表达高于肿瘤细胞K562,而且Pten抑制的mTOR信号通路中关键蛋白表达均明显低于K562,尤其以p-4E-BP1表达低.提示PI3K/Akt/mTOR信号通路下游磷酸化蛋白在人胚胎干细胞活性较低,如果抑制负调节蛋白PTEN或直接激活该通路正调节关键蛋白,可能会加快人胚胎干细胞增殖、减少凋亡,进而为定向分化、再生医学提供更多的细胞来源.
关键词： 人胚胎干细胞 PI3K/AKT/mTOR信号通路 PTEN基因 下游蛋白 磷酸化 -
人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较
背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系.目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09,2009-02在中国科学院昆明动物所完成.材料:清洁级孕12.5～13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供.永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供.方法:无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×10~4/cm~3接种在明胶包被的6孔板中.取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子.主要观察指标:两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间.结果:培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Sct-4,但不表达SSEA-1.与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P<0.05),倍增时间明显延长(P<0.05).结论:人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异.
-
人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性
背景:建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节.目的:体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性.方法:取ICR小鼠13.5 d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察.结果与结论:复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30 min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长.提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞.
-
CD271磁珠体外诱导人胚胎干细胞分化为成骨细胞的可行性
背景:来源于人胚胎干细胞的成骨细胞研究结果引人关注,但是能够产生大量有效的成骨细胞且不含有其他杂细胞的诱导方法仍然没有建立起来.目的:探讨利用CD271磁珠从体外诱导分化的人胚胎干细胞中分选出成骨细胞的可行性.方法:人胚胎干细胞株SYSU-2形成拟胚体6 d,贴壁分化14 d后,通过CD271磁珠分选技术获得CD271阳性细胞,进一步检测CD271阳性细胞核型,表面抗原表达及分化潜能.结果与结论:CD271阳性细胞与骨髓来源的间充质干细胞形态相似,为长梭形,并可在体外保持稳定核型至14代左右.同时,这种细胞也具有与骨髓来源的间充质干细胞相似的表面抗原标记(CD45阴性和CD73,CD105,CD166阳性).分化潜能鉴定证明CD271阳性细胞只能诱导形成成骨细胞.这对于研究成骨发育的机制和为骨组织工程提供足量安全有效的种子细胞都有着重要意义.
