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高通量筛选在抗病毒药物筛选中的应用
细胞和分子生物学的迅速发展为药物作用靶点研究提供了新的领域,大量分子细胞水平的药物筛选模型不断出现,并应用到药物筛选和研究中.
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基于报告基因的化学预防剂细胞筛选模型的建立
目的:建立基于报告基因和抗氧化反应元件(anti-oxidative response element,ARE)的药物筛选细胞模型,为化学预防剂的筛选奠定基础.方法:构建重组报告基因表达载体p4ARE-TK-GFP/neo,并将其转入HepG_2细胞中,利用已知化学预防剂检测该细胞模型,并观察白藜芦醇、原儿茶醛、熊果酸和齐墩果酸4种中药单体不同浓度(0,12.5,25,50,100,200 μmol·L~(-1))对GFP报告基因表达活性的影响.结果:表达载体p4ARE-TK-GFP/neo中GFP的表达受ARE的调控,其表达水平高于对照载体且在一定范围内与化学预防剂的浓度呈剂量效应关系.4种中药单体中白藜芦醇有较好的诱导效果.结论:利用此模型通过测定GFP报告基因的诱导表达水平可筛选得到新结构的化学预防剂.
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现代生物技术在中药活性组分筛选中的应用
中药活性组分的确定是中医药现代化这个系统工程中一个十分重要的内容,阐明中药的活性组分,有利于科学地解释中药的作用机理,制定科学的中药生产加工质量控制标准,也有利于实现中药现代剂型的研制及中药的二次开发.传统的中药活性组分筛选的程序是对有效复方或单味药进行化学分离,制备出活性部位或单体,然后利用实验动物进行在体药理活性验证,消耗样品量大、使用大量的实验动物,劳动强度高、耗时耗力,并且一次试验筛选样品量有限,不适合成分复杂的中药活性组分的筛选.高通量药物筛选技术是以细胞水平、分子水平药物筛选模型为主的,结合组合化学、自动化技术建立的大规模筛选药物的方法,该技术的基本思路是直接观察药物与药物靶标的相互作用,使用样品量少,实验周期短,是更为适合成分复杂的中药活性组分筛选的新型技术.
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药物筛选模型研究进展
药物筛选模型（drug screening model, drug screening assay method）是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，这些实验方法是寻找和发现药物的重要条件之一。人们在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极作用。随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，这些新的筛选模型不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响［1］。本文对近年来药物筛选模型的研究进展作简单综述。
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基于报告基因的雌激素受体α亚型配体筛选模型的建立和应用
目的建立基于报告基因的雌激素受体α亚型配体的筛选模型,用此模型对收集到的化合物进行筛选,以发现具有新结构的雌激素受体配体.方法构建诱导性表达载体并转染入ERα +HepG2细胞中,筛选报告基因CAT表达受雌二醇诱导的阳性克隆.采用ELISA法检测化合物对CAT表达的影响,体外细胞存活实验对化合物进行功能性检测.结果 ERα +HepG2细胞中CAT的表达受雌二醇的诱导并呈现剂量依赖关系.化合物三羟基二苯乙烯诱导CAT表达的大活性为雌二醇的1.75倍.结论利用此模型通过测定CAT基因的诱导表达水平可筛选得到新结构的雌激素受体配体.
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利用微生物基因组开发新型抗生素
20世纪医药界大成就之一是发现抗生素控制传染病，但是细菌很快对它产生了耐药性。例如1943年开始工业化生产青霉素，但是1947年就报道了耐药菌株。随后世界上不少机构开始监测耐药性的传播。1998年英国发现链球菌菌血患者中30%是由耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌所致，1994年的比例仅为2%；美国1979，1987年仅0.2%的肺炎球菌耐青霉素，1994年上升至6.6%(www.fda.gov/fdac/features/795-antibio.html)。80年代末90年代初发现耐万古霉素肠球菌，1997年分离到耐万古霉素金黄色葡萄球菌。更严重的是出现了同时耐多种药物的菌株。1968年引起危地马拉12 500人死于腹泻的致病菌所含质粒可耐4种药物。筛选抗生素是通过负选择，但是产生耐药却是正选择，耐药菌株在种群中扩散迅速，运动元件水平转移(horizontal mobile element, HME)在种内和种间都可发生，耐药机制也日趋复杂。
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Notch信号通路体外和细胞的药物筛选模型的建立和研究
Notch信号通路与生物体的发育及多种癌症的发生密切相关,目前针对Notch信号通路的药物筛选模型均以鼠源Notch蛋白为底物,未见以人源Notch为底物的报道.本文克隆并表达提纯了人源Notchl截短形式N100,以之为底物首次构建了Notch信号通路体外和细胞的药物筛选模型.同时,用已知Notch通路抑制剂对此模型进行了验证,得到了相应的IC50值.本研究构建的模型能有效应用于人源Notch信号通路的调控剂筛选,为高效发现靶向Notch通路的调控剂奠定了基础.
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卡托普利单次和多次给药对自发性高血压大鼠模型的作用
目的 探讨自发性高血压大鼠(SHR)是否同时适用抗高血压药物单次给药的快速评价和连续给药的降压效果评价.方法 SHR大鼠分组给药后,用Powlab/16sp测量单次和多次给药后不同时间点SHR大鼠SAP、DAP、BMP和HR的变化.结果 卡托普利单次给药1～2 h内对收缩压和舒张压有明显的降压作用(P<0.05),而连续给药随着给药时间延长给药28 d降压作用更为明显(P<0.01).结论 自发性高血压大鼠既可用于降压药连续给药的药效学评价,也适用于单次给药的降压药快速筛选.
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人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的建立
目的建立靶向人高密度脂蛋白受体基因(CLA-1)调控序列的药物筛选模型,为筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂奠定基础.方法PCR扩增CLA-1上游调控序列,构建重组报告基因质粒pGL3-CLAP,瞬时转染人肝癌细胞BEL-7402,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化筛选人高密度脂蛋白受体表达上调剂.结果建立了CLA-1表达上调剂筛选模型,pGL3-CLAP与阴性对照pGL3-Basic组间差异显著(P＜0.001),变异系数(CV)不超过10%.对124个化合物和800个微生物次级代谢产物进行初筛和复筛,1个化合物和3个菌株发酵液为阳性.结论该系统可有效地应用于人高密度脂蛋白受体表达上调剂的高通量筛选.
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人胚胎干细胞向成纤维细胞分化方法的专家共识
人胚胎干细胞（ESC）是一类从囊胚期的人胚胎内细胞团中分离所得的，具有体外自我更新稳定性并维持正常核型和发育多能性，甚至参与整个个体发育的高度未分化干细胞［1］。利用人ESC或由其分化而成的人体细胞、组织或器官来测试各种生物医用材料、食品及药物对人体的毒理特性或药效，较运用动物或永生化细胞更能反映人体真实的状况。因此，人ESC及其分化的细胞有望发展成为一种崭新的生物安全性检测和药物筛选模型［2］。目前多数研究仍用永生化细胞系或原代培养细胞进行生物材料的安全性评价［3-4］，分别存在核型异常或批次差异大等缺点。人ESC来源的成纤维细胞（ ES-F ）具有来源稳定，核型正常以及容易标准化等优点［5-6］，有望成为生物安全性评价体系的新模型［7］。规范人ESC向成纤维细胞分化方法是保证生物安全性检测评价模型可靠性的关键。为此，科技部国际科技合作重点项目“创建基于人胚干细胞的预测健康安全新体系”的项目组专家经反复讨论，制定了“人胚胎干细胞向成纤维细胞分化方法的专家共识”（以下简称“共识”），旨在规范人ES-F的分化方法，提高人ES-F的纯度，保证分化方法的可重复性，使其更系统、规范和有效地应用于临床和生物安全性评价体系中。
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半脾模型在裸鼠结直肠癌肝转移中的实验研究
目的：建立稳定的裸鼠结直肠癌肝转移半脾模型。方法利用裸鼠脾脏的特殊解剖，建成半脾模型后，将人HT29结直肠癌细胞接种于近端半脾被膜下，远端半脾埋入皮下备治疗所需。采用不同浓度的肿瘤细胞（5×105／100μL、1×106／100μL及5×106／100μL）或不同浓度的环磷酰胺（ L－CTX和H－CTX），共分6组观察制模30天后的肝转移评分、淋巴结转移及血性腹水情况。结果人HT29结直肠癌细胞建立的肝转移半脾模型成瘤率和减瘤率皆为100％。 L－CTX治疗组和H－CTX治疗组观察结果，发现随结直肠癌细胞浓度梯度的增高肝转移评分也增高，其不同浓度梯度间的差异有显著性意义（两组均为P＜0．05）。 L－CTX治疗组淋巴结转移和血性腹水明显少于H－CTX治疗组，其差异也有显著性意义（P＜0．05）。人HT29结直肠癌细胞浓度梯度为1×106／100μL制模组，显示其模型稳定性和抗肿瘤药物的敏感性好。结论裸鼠结直肠癌肝转移半脾模型为结直肠癌肝转移的生物学机制和抗转移治疗提供了较为理想的实验模型。肝转移半脾模型为抗肿瘤药物体外筛选模型方法，其模型的建立能应用于抗肿瘤药物的筛选。
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抗抑郁药筛选模型的研究进展
抗抑郁药是近年药物研发领域的热点之一.现有抗抑郁药主要通过系统筛选途径获得,本文回顾多种体内和体外药物筛选模型,综述其在抗抑郁药筛选中的研究进展.
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新兴的受体技术与新药筛选
在药物研究过程中,发现具有药物活性的物质是一个极为重要的过程.在人类文明的整个进程中,从神农尝百草的亲身体验到采用动物实验是一次巨大的飞跃.当前开发新药所面临的一个大的难题在药物筛选方面.显然,药物筛选的模型越多越先进,发现新药的机率就越高,研制新药的速度也越快.从国外的发展来看,药物筛选模型和方法大致经过了3个阶段[1]:(1)经典的动物普筛方法,耗时长,浪费大,又容易漏筛,在实际应用中受到很大限制;(2)酶筛选方法中应用各种与疾病有关的酶作为筛药工具,建立了各种酶抑制剂筛选模型.例如,以血管紧张素酶为靶酶筛选的卡托普利、依那普利巳广泛应用于临床.
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α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达
建立以哺乳动物α3β4乙酰胆碱受体(nAChR)为分子靶标的药物筛选模型.将大鼠乙酰胆碱受体的α3与β4亚基基因分别进行体外转录,获得α3与β4亚基基因的cRNA,按1:1的比例将适量α3与β4的cRNA 混合后,显微注射到新鲜分离的非洲爪蟾卵母细胞中,在ND96溶液中、17℃下培养24 h后,通过双电极电压钳技术(TEVC)检测受体α3β4nAChR的乙酰胆碱(Ach)门控电流.同时注入α3、β4cRNA的非洲爪蟾卵母细胞孵育24h后,可记录到明显的Ach门控内向电流,未注射或只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生.α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,以此为药物作用靶点,可用于大量生物毒素等物质的活性筛选实验模型.
关键词： α3β4乙酰胆碱受体 双电极电压钳 非洲爪蟾卵母细胞 药物筛选模型 -
基于tyrp1a转基因斑马鱼构建色素障碍性疾病药物筛选模型
为了能够有效地筛选治疗色素障碍性疾病药物,建立一种转基因斑马鱼药物筛选模型.采用斑马鱼酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1a,tyrp1a)基因启动子驱动绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),构建出tyrp1a转基因斑马鱼,使绿色荧光能够特异性表达在斑马鱼黑素细胞部位.分别给予斑马鱼促进黑素合成的药物N-苯基硫脲(N-phenylthiourea,PTU)和抑制黑素合成的药物黑素细胞刺激素(alpha-melnaocyte stimulating hormone,α-MSH),检测药物对斑马鱼黑素合成和绿色荧光蛋白表达影响.结果显示,FTU可以抑制斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并且降低转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达.α-MSH可以促进斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并促进转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达.本研究成功地建立了一种新的可以用于色素性障碍疾病药物筛选的转基因斑马鱼模型.
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PDGFR-β抑制剂细胞筛选模型的构建及应用
目的 建立针对以血小板衍生生长因子受体-β(platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)为靶标的特异及灵敏的细胞模型体系,用于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTK)抑制剂的筛选和研究.方法 构建人的PDGFR-β真核表达载体pcDNA3.1-PDGFR-β,将其转染至NIH 3T3细胞,获得稳定转染的细胞克隆,并对其进行功能学鉴定及应用;应用瞬时转染PDGFR-β的HeLa细胞,建立PDGF依赖性的受体磷酸化细胞模型.结果 在无血清培养条件下,稳定转染人PDGFR-β的NIH 3T3细胞获得了PDGF依赖性的细胞增殖特征;HeLa细胞经瞬时转染PDGFR-β后,可以检测出明显的PDGF依赖性的受体酪氨酸磷酸化.通过应用已知PDGFR-β抑制剂及自行合成化合物,确证了以上细胞模型具有机制针对性特征.结论 所构建并确证的细胞模型具有特异性和灵敏性,适用于较高通量的PDGFR-β和其它RTK抑制化合物的体外筛选与研究.
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基于抗氧化反应元件的药物筛选模型的建立
目的 建立基于抗氧化反应元件(antioxident response element,ARE)和SEAP报告基因的细胞筛选模型,用此模型对金雀异黄素、芹菜苷配基、儿茶素、茨非醇4种化合物进行活性比较,观察上述化合物拮抗过氧化氢损伤的作用,寻找具有强抗氧化活性作用的黄酮类化合物.方法 构建重组报告基因表达载体pARE-TAL-SEAP与对照载体分别转染HEK-293细胞,检测上述黄酮类化合物作用后对SEAP的活性和抗氧化作用的影响.结果 在加入25 μmol·L-1 H2O2进行氧化损伤的HEK-293细胞中,加入100 μmol·L-1的4种化合物进行比较时金雀异黄素的抗氧化作用强,金雀异黄素诱导SEAP的大表达水平较对照孔升高1.3倍;加入25 μmol·L-14种化合物的抗氧化作用时茨非醇的抗氧化作用强,茨非醇诱导SEAP的大表达水平较对照孔升高1.5倍.结论 利用此模型可以检测H2O2的氧化应激反应并可筛选到抗氧化活性强的黄酮类化合物.
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一种筛选抗心律失常药物新模型的建立
目的建立一种细胞水平的心律失常模型,以用于抗心律失常药物的筛选和评价.方法酶解法分离单个大鼠心室肌细胞,在细胞水平给予传统诱发心律失常药物乌头碱,应用膜片钳技术观察记录应用乌头碱后心肌动作电位时程(APD)、钠电流(INa)、L-型钙电流(ICa-L)、内向整流钾电流(IK1)及瞬时外向钾电流(Ito)的变化.结果应用乌头碱1 μmol*L-1使大鼠单个心室肌细胞90%复极化动作电位时程(APD90)从给药前的(150.23±7.02) ms延长至(236.03±23.22) ms(n=8,P<0.01).应用奎尼丁10 μmol*L-1后动作电位时程延长与乌头碱组比较,APD90进一步延长(n=6,P<0.05),但应用维拉帕米10 μmol*L-1后被乌头碱延长的APD恢复近于正常,在乌头碱的作用下,除极电压为0 mV时ICa-L从(727.9±178.0) pA增加至(1082.1±222.2) pA(n=6,P<0.01);钠电流(INa)在-50 mV刺激电压下从(254±55.3) pA增加至(4530.2±475.1) pA(n=4, P<0.05);IK1在-120 mV的刺激电压下,Ik1的内向成分从(2007.1±359.3) pA增加至(2317.7±401.8) pA(n=10, P<0.01);奎尼丁、维拉帕米对乌头碱诱发的钠电流和钙电流增加有抑制的作用.结论乌头碱使大鼠单个心室肌细胞APD明显延长,并增加INa, ICa-L和IK1.维拉帕米对乌头碱大鼠单细胞模型APD的延长有恢复作用,并抑制乌头碱诱发INa, ICa-L升高.因此抑制INa, ICa-L及使动作电位时程恢复正常是抗心律失常药物作用的佳靶点,而且乌头碱大鼠单细胞模型是一种稳定可靠的抗心律失常药物筛选模型.
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基于STAT3转录调节的筛药模型的建立
目的依据造血生长因子信号转导途径中重要转录因子STAT3的转录调节作用建立基于报告基因的靶向STAT3转录调节的筛药模型,用此模型筛选具有G-CSF样活性的化合物.方法构建诱导性表达载体pTKS3-CAT并转染入表达G-CSF受体的NFS-60不依赖细胞,筛选报告基因CAT表达受rhG-CSF诱导的阳性克隆,采用ELISA法检测化合物对CAT表达活性的影响.同时,对模型的特异性和灵敏性进行检测.结果在转染有重组质粒的NFS-60不依赖细胞中,CAT表达受rhG-CSF诱导并呈剂量依赖关系,EC50等于0.044nmol·L-1,而rhEPO不能诱导CAT表达.结论以上模型的CAT基因表达活性能够被其特异性配体强诱导表达,利用此模型在96孔板上用ELISA法测定CAT基因的诱导表达水平可筛选具有G-CSF样活性的化合物。
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芳香化酶抑制剂筛选模型的研究进展
芳香化酶是生物体催化雄性激素转变为雌性激素的限速酶,以其为靶点筛选芳香化酶抑制剂,在雌激素受体阳性乳腺癌患者的治疗中具有重要地位.本文综述了芳香化酶抑制剂筛选模型的研究进展,讨论后发现,现有的各筛选模型优劣共存,通过深入研究,可建立新型的高通量筛选模型,发展前景广阔.
