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氯化镧通过细胞周期机制促进NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞增殖
镧离子(La3+)对NIH 3T3小鼠胚胎成纤维细胞的增殖有重要影响,但其机理尚需深入研究.在本研究中,我们运用增殖分析、周期阻滞-释放和BrdU追踪等方法详细分析了La3+对NIH 3T3细胞增殖及细胞周期动力学的影响.结果显示,La3+处理12小时即有显著促增殖作用,在48小时促增殖效应的EC50为2.4 μM. La3+促NIH 3T3细胞增殖的作用也在BrdU掺入实验中得到了验证.La3+推动更多细胞跨过G1/S周期检查点进入S期,但不改变细胞周期的时间长度.免疫荧光染色发现,La3+处理增加了两个关键细胞周期调控因子cyclin D1和c-Myc的蛋白水平和细胞核定位.本研究显示La3+的促增殖作用与报道的可能引起肾源性系统性纤维化疾病的Gd3+非常相似,并提供了镧系元素细胞生物学活性的新信息.
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血管内皮生长因子-2抑制剂细胞筛选模型的构建及应用
目的 建立针对以血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)为靶标的特异及灵敏的细胞模型体系,用于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTK)抑制剂的筛选和研究.方法 构建人源VEGFR-2真核表达载体pcDNA3.1-VEGFR-2,将其转染至NIH 3T3细胞,获得稳定转染的细胞克隆,并对其进行功能学鉴定及应用；应用瞬时转染VEGFR-2的HeLa细胞,建立VEGF依赖性的受体磷酸化细胞模型及应用.结果 在无血清培养条件下,稳定转染VEGFR-2的NIH 3T3细胞获得VEGF依赖性的细胞增殖特征；HeLa细胞经瞬时转染VEGFR-2后,可以检测出明显的VEGF依赖性的受体酪氨酸磷酸化.通过应用已知VEGFR-2抑制剂及自行合成化合物,确证以上细胞模型具有较高机制针对性的特征.结论 所构建并确证的细胞模型具有较高特异性和灵敏性,可适用于VEGFR-2和其他RTK抑制化合物的体外筛选与研究.
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醉香含笑根皮挥发性成分的GC-MS分析及对NIH3T3细胞生长抑制作用
目的 分析醉香含笑根皮的挥发性成分,并考察醉香含笑根皮提取物(REMMD)对小鼠成纤维细胞NIH 3T3的体外生长抑制作用.方法 水蒸气蒸馏法提取醉香含笑根皮的挥发性成分,用气相-质谱联用(GC-MS)技术分析,并用峰面积归一化法测定各成分相对含量；采用MTT法检测REMMD对NIH 3T3细胞体外生长抑制作用.结果 共检出57个色谱峰,确定了其中31种化合物,占该挥发性成分总量的63.31％.结论 REMMD的挥发性成分以N,N,N'-二苯甲酰基-庚二胺为主(28.97％),其他成分有棕榈酸及棕榈酸乙酯(7.03％)、高香草酸(3.25％)、4-[(1E)-3-羟基-1-丙烯基]-2-甲氧基-苯酚(3.16％)、木香烯内酯(2.33％)、糠醛及其衍生物(2.5％).25,50,75,100 μg·mL-1的REMMD能显着抑制NIH 3T3细胞的生长,其抑制率呈浓度依赖关系,提示其具有抗纤维化疾病的良好研究开发前景.
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重组anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建
目的:构建pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体,转染PA 317细胞株,包装制备重组非复制型逆转录病毒.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,经G418筛选,收获上清液获非复制型逆转录病毒,将病毒感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞中的表达情况,确定病毒滴度.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建;采用PCR方法能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段;流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白.
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PDGFR-β抑制剂细胞筛选模型的构建及应用
目的 建立针对以血小板衍生生长因子受体-β(platelet-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)为靶标的特异及灵敏的细胞模型体系,用于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,RTK)抑制剂的筛选和研究.方法 构建人的PDGFR-β真核表达载体pcDNA3.1-PDGFR-β,将其转染至NIH 3T3细胞,获得稳定转染的细胞克隆,并对其进行功能学鉴定及应用;应用瞬时转染PDGFR-β的HeLa细胞,建立PDGF依赖性的受体磷酸化细胞模型.结果 在无血清培养条件下,稳定转染人PDGFR-β的NIH 3T3细胞获得了PDGF依赖性的细胞增殖特征;HeLa细胞经瞬时转染PDGFR-β后,可以检测出明显的PDGF依赖性的受体酪氨酸磷酸化.通过应用已知PDGFR-β抑制剂及自行合成化合物,确证了以上细胞模型具有机制针对性特征.结论 所构建并确证的细胞模型具有特异性和灵敏性,适用于较高通量的PDGFR-β和其它RTK抑制化合物的体外筛选与研究.
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稳定表达EGFR胞外区的NIH3T3细胞株的建立及鉴定
目的 构建稳定表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外区(EGFRex)的NIH3T3细胞株.方法 构建带有EGFRex基因的重组真核表达质粒PLNCX2-EGFRex,经脂质体法转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,用免疫组化和蛋白质印迹(Western blot)检测EGFRex蛋白的表达,用EGF-EGFP蛋白检测其活性.结果 成功构建了真核表达载体PLNCX2-EGFRex.以其转染NIH3T3细胞后,经免疫组化和Western blot检测到EGFRex的表达.在荧光显微镜下见细胞膜上有绿色荧光.结论 人EGFRex在NIH3T3细胞内以其天然活性形式稳定表达,为抗体制备奠定了基础.
关键词： 表皮生长因子 NIH 3T3细胞 基因表达 表皮生长因子受体胞外区 -
大鼠IP-10-PE38 KDEL重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达
目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白10(rIP-10)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)基因的真核融合表达载体,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况.方法通过PCR获得本实验需要的rIP-10基因片段,通过酶切原核表达载体PTKL459K-IL-4-PT38KDEL获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建rIP-10与PE38KDEL融合基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rIP-10-PE38KDEL.重组质粒经限制性性内切酶,PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测rIP-10-PE38KDEL融合蛋白在NIH 3T3细胞的表达.结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,rIP-10-PE38KDEL融合基因被成功克隆人真核表达质粒载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组基因可在NIH 3T3细胞表达.结论 rIP-10-PE38KDEL融合基因可在NIH 3T3细胞中表达,为进一步研究其对自身免疫病的Th1细胞靶向毒性及临床应用奠定基础.
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大鼠干扰素诱导蛋白-10真核表达质粒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达
目的构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)基因的真核表达质粒,并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况.方法通过PCR获得实验所需的IP-10基因片段,通过酶切IP-10基因片段、真核表达质粒载体pEGFP-c1和连接反应,构建IP-10的真核表达质粒pEGFP-c1-IP-10,重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测pEGFP-c1-IP-10在NIH 3T3细胞中的表达.结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因片段被成功克隆入真核表达质粒载体pEGFP-c1,免疫荧光技术检测证实,该基因能在NIH 3T3细胞中表达.结论证实IP-10基因可在NIH 3T3细胞中表达,为将其作为DNA疫苗治疗自身免疫性疾病的研究奠定了基础.
