甘草鲨烯合酶基因多态性对其编码酶催化效率影响的研究

目的:分析甘草鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因多态性及其对编码酶催化效率的影响,为揭示优质甘草形成的分子机制奠定基础.方法:提取甘草总RNA; PCR扩增其SQS基因编码序列；测序后分析SQS序列的多态性；将具有明显差异的4个甘草SQS序列(SQS1C,SQS1F,SQS2A,SQS2B)连入表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21；IPTG诱导蛋白表达,纯化后用于体外酶促反应；GC-MS鉴定产物并比较相对含量.结果:甘草SQS1基因存在单核苷酸多态性(single nuclear polymorphisms,SNPs)、插入与缺失多态性(InDel)、选择性剪接(AS)多态性；SQS2基因只存在SNPs.氨基酸序列分析显示,SQS1非保守替换占53.94％,结构域中有2个位点突变；SQS2非保守替换占60％,结构域中有1个位点突变.在4种编码酶的体外酶促反应中,利用GC-MS均能检测到产物生成；SQS1F编码酶积累鲨烯的能力高于其他序列.结论:甘草SQS基因具有丰富的多态性,其编码酶催化效率差异显著,这可能是优质甘草形成的分子基础.

CD49f剪接异构体在不同细胞系中的表达

目的 比较CD49f选择性剪接异构体在人不同来源干细胞以及结肠癌细胞系中的表达,并构建特定异构体过表达载体用于功能研究.方法 RT-PCR及real-time PCR检测CD49f选择性剪接异构体在不同细胞中的表达;分子克隆方法构建各异构体的慢病毒过表达载体;流式细胞计量术、Western blot及real-time PCR检测CD49f各异构体的过表达;Transwell方法检测细胞侵袭能力的改变.结果 人胚胎干细胞系H9中表达CD49f异构体B,而上皮类细胞仅表达异构体A;间质细胞中二者均有表达,但异构体A表达多于异构体B;检测的4个结肠癌细胞系中CD49f异构体A和B均有表达,其中HT29和HCT116中以异构体A为主,而HCT8和LoVo中异构体B的表达更为明显.构建的慢病毒表达载体可使HT29中CD49f异构体A和B获得特异性过表达,其中异构体B的过表达使HT29的侵袭能力增加.结论 不同类型细胞中CD49f选择性剪接异构体A和B的表达存在显著差异,二者的生物学功能具有差别.

CKS2shRNA慢病毒表达载体的构建及其抑制卵巢癌A2780细胞增殖

目的 构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并探讨CKS2敲除对卵巢癌细胞A2780增殖的影响.方法 根据siRNA原理设计两对靶向CKS2的shRNA序列(shRNA1、shRNA2)及阴性对照NC shRNA,并克隆到慢病毒表达载体PL-KO.1/puro中;将上述质粒转染到293T细胞并包装出慢病毒,用慢病毒感染卵巢癌细胞A2780,实时定量PCR及Westernblot检测CKS2表达;MTT法检测A2780细胞增殖;Western blot检测PARP-1的剪切;流式细胞术检测凋亡.结果 成功构建CKS2 shRNA慢病毒表达载体能明显降低A2780细胞中CKS2 mRNA及蛋白表达(P＜0.05);能显著抑制A2780靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并包装出慢病毒;感染A2780细胞后,细胞增殖受抑(P＜0.05);能诱导PARP-1蛋白的剪切及凋亡(P＜0.05).结论 成功构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,能显著抑制A2780细胞增殖.

FGFR2异构体及相关剪接因子在人胚胎干细胞和成体干细胞中的表达

目的 比较FGFR2异构体及其剪接因子在人胚胎干细胞(hESCs)及其分化的拟胚体(EBs),以及骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和毛囊干细胞(HFSCs)等不同组织来源成体干细胞(ASCs)中的表达.方法 用RT-PCR、免疫荧光染色和流式细胞仪分析鉴定hESCs、EBs和ASCs的生物学特性;用real-time PCR比较FGFR2异构体Ⅲb、Ⅲc及相关剪接因子的表达.结果 FGFR2的选择性剪接在hESCs、EBs和ASCs中均以Ⅲc为主.hESCs向EBs分化后,Ⅲb和Ⅲc的表达及Ⅲb/Ⅲc比值均升高,EBs中抑制Ⅲc表达的剪接因子FOX2和抑制Ⅲb表达的剪接因子HnRNPA1分别在分化第7天和第14天表达升高(P＜0.05).FGFR2异构体在hESCs与HFSCs中的表达水平显著高于在BMSCs和ADSCs中(P＜0.01),在BMSCs中的表达水平显著高于在ADSCs中(P＜0.05).多种FGFR2相关剪接因子在hESCs和HFSCs中的表达水平显著高于在BMSCs和ADSCs中(P＜0.05).结论 FGFR2异构体及其相关剪接因子在不同分化阶段和组织来源的干细胞中有不同的表达谱.

胶质瘤中PTB调控长非编码RNA选择性剪接的筛选

目的 探究在神经胶质瘤发生发展过程中PTB调控选择性剪接的长非编码RNA.方法 全转录组芯片分析筛选受PTB蛋白介导影响选择性剪接的长非编码RNA.提取胶质瘤和正常细胞系及临床病例组织样品和敲低PTB的神经胶质瘤细胞总RNA,实时荧光定量 PCR验证候选基因不同剪接异构体的表达及比值变化.核质分离实验鉴定长非编码RNA细胞定位.结果 筛选出16条受PTB蛋白介导影响选择性剪接的长非编码RNA,其中linc00882的不同剪接异构体的表达模式受PTB调控所产生的差异明显.检测到linc00882定位于细胞质.结论神经胶质瘤中PTB蛋白参与长非编码RNA linc00882的选择性剪接.

ESRP1剪接变异体的克隆及其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的 克隆ESRP1剪接变异体并构建其慢病毒表达载体,研究其对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖的影响.方法 以OVCAR3细胞的cDNA为模板,PCR扩增ESRP1剪接变异体,将其连接到带有Myc标签的pCMV-Myc真核表达载体;再以该真核表达载体为模板,将含有Myc标签的ESRP1剪接变异体克隆到慢病毒表达载体pLV-tTR/KRAB-Red上,从而构建带有Myc标签的ESRP1剪接变异体慢病毒表达载体;用该慢病毒表达载体转染293T细胞,包装慢病毒;用该慢病毒感染MDA-MB-231细胞,用MTT法检测该细胞增殖,用Western blot检测该细胞中PARP蛋白的表达.结果 成功构建带有Myc标签的ESRP1剪接变异体慢病毒表达载体,并包装出慢病毒;用该慢病毒感染MDA-MB-231细胞后,与空载体对照组比较,ESRP1过表达能明显抑制MDA-MB-231细胞增殖(P＜0.05);ESRP1过表达能诱导PARP蛋白的剪切.结论 成功构建带有Myc标签的ESRP1剪接变异体的慢病毒表达载体;ESRP1过表达能抑制MDA-MB-231细胞增殖,这可能与细胞死亡有关.

SVA反转录转座子的研究进展

SVA反转录转座子在人类基因组中的拷贝数约2 700个,可通过DNA-RNA-DNA的途径实现反转录转座,SVA插入到基因组中,从而改变基因组的结构和功能.SVA反转录转座子不仅对人类基因组的进化做出了重要贡献,还是多种疾病的重要原因.

上皮剪接调节蛋白1（ESRP1）在人卵巢癌组织及细胞系的表达

＿＿卵巢癌是危害广大妇女健康常见的恶性肿瘤之一。人上皮剪接调节蛋白1（ epithelial splicing regulatory protein 1， ESRP1）通过与富含UGG的序列结合，可促进上皮基因亚型的选择性剪接，如成纤维细胞生长因子受体2（ fi－broblast growth factor receptor 2， FGFR2）［1］。近期研究表明：人乳头瘤病毒 HPV16癌蛋白E5可通过 ESRP1诱导FGFR2 b向FGFR2 c亚型的转换，从而使宫颈癌细胞发生上皮间质转化及转移，这表明ESRP1可能和宫颈癌转移事件有关［2］。 ESRP1在卵巢癌中是否具有作用以及具有怎样的作用，目前没有文献报道。本研究拟检测卵巢癌组织及细胞系中ESRP1表达水平，及其与FGFR2亚型转换的关系，为研究ESRP1在卵巢癌中的作用及分子机制提供实验依据。

选择性矩阵--一种研究基因选择性剪接的方法

抗性家蝇para基因的选择性剪接和位点突变

为了在分子水平上研究拟除虫菊酯抗性家蝇靶标抗性机制,根据昆虫para型钠通道Ⅱ区S4至S6及Ⅱ与Ⅲ连接区的保守区域,设计简并引物,利用降落RT-PCR,克隆拟除虫菊酯kdr(R品系)家蝇para型钠通道704bp的cDNA,根据此序列用Primer Premier 5.0设计特异引物,分别扩增敏感(SS品系)、 super-kdr(RR品系)家蝇各651bp的cDNA.结果SS无有义突变,R和RR在ⅡS6 CTT到TTT的替换导致Leu 1014到Phe的保守性突变,RR在Ⅱ S 4～5细胞内片段接头处没有与超-kdr抗性相关的Met到Thr突变;另外首次发现kdr(R品系)家蝇在Ⅱ与Ⅲ连接区出现39bp的选择性剪接,构成家蝇para钠通道亚型(命名为xych,GenBank登陆号为AF411452).

胆汁酸代谢与调节中的选择性剪接

胆汁酸是胆固醇代谢的主要产物,胆汁的主要成分,影响着肝脏胆汁分泌和小肠对脂肪及脂溶性维生素的吸收.胆汁酸的代谢包括合成、摄取转运、加工、排泄和肠肝循环等过程,有多种酶和转运蛋白的参与,并被胆汁酸通过法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor,FXR)介导的多条通路进行转录调节.近年来的研究发现选择性剪接广泛存在于真核细胞的转录后修饰过程,是增加真核生物多样性的重要机制,影响着mRNA的转录调节与稳定性、蛋白质的细胞定位与功能.本文将就胆汁酸的合成与转运过程、FXR介导的转录调节、相关基因选择性剪接的形式与功能改变进行综述.

IGF-1基因产物的结构和功能多样化

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因包含6个外显子,具有转录和翻译产物多样化的特点,原因在于存在多个转录起始位点的选择性应用,转录产物的选择性剪接,以及不同多聚腺苷酸化位点的使用.长期以来人们普遍关注由外显子3和4编码的循环型IGF-1在生长发育中的作用,近对肌肉、神经等组织自分泌/旁分泌的局部型IGF-1研究发现,选择性剪接产生的IGF-1变体具有外显子5和6编码的延伸肽(E肽),并表现出特殊的生物学功能,如IGF-1Ea、IGF-1Eb(MGF)及其E肽在骨骼肌、心肌、神经等组织中表现出促进生长和损伤修复的功能,这些特殊功能可能通过细胞表面的一种特殊E肽受体介导.

一个RNA剪接调控元件分类方法的研究

序列分类方法被广泛应用于各种生物信息学问题,例如转录调控元件识别和蛋白结构预测.本研究设计了一个新的基于序列特征的分类方法,并将其用于RNA剪接调控元件的研究.该方法从已知剪接元件中抽取序列特征,构建一个打分算法,由此预测未知元件RNA剪接调控功能.作为应用实例,采用已知外显子剪接增强子和沉默子(ESE和ESS)八联体作为实验数据,对本方法和若干已知常用方法的预测结果进行比较,3类计算验证实验中的平均预测精度为93％,表现出良好预测精度,且其透明的预测结构可帮助进行生物解释.该研究提供了一种可用于分析生物序列数据的新方法,给出了一个从生物信息学角度来研究基因调控问题的新途径.

选择性剪接机制及其在白血病诊疗中的应用

选择性剪接是指真核细胞选择性地对前信使RNA (pre-mRNA)剪接位点的组合剪接加工,形成不同的成熟信使RNA(mRNA),从而使一个基因产生若干有独特结构和功能的蛋白质异构体的过程.其过程受多种顺式作用元件和反式作用因子的调控.近年发现异常选择性剪接在多种不同类型白血病患者体内普遍存在,与白血病的发生、发展及化疗抵抗等密切相关,在白血病诊断及治疗中有广阔的应用前景.

受体酪氨酸激酶基因及其变异体在膀胱肿瘤组织中的表达及意义

目的 探讨RON mRNA及其变异体在膀胱肿瘤组织中的表达与临床意义。方法选择63例膀胱移行上皮癌(TCCB)、7例膀胱内翻性乳头状瘤(IPB)、9例膀胱低度恶性潜能尿路上皮瘤(PUNLMP)患者和12例外伤性膀胱破裂且经病理证实无肿瘤细胞的正常膀胱黏膜组织患者。其中，病理Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级患者分别为30、15和18例，临床Tis+ T1和T2 +T3 +T4期患者分别为44例和15例；用实时荧光定量RT-PCR检测其RON mRNA相对表达量，以GAPDH mRNA为内标物，用RONmRNA/GAPDH mRNA比值表示RON mRNA相对表达量；用RT-PCR检测RON mRNA选择性剪切形成的变异体；用测序检测PCR产物中可能存在的变异体，并分析变异体在不同组织间及TCCB中不同病理分级及临床分期间阳性表达率的差异。结果RON mRNA在TCCB、IPB、PUNLMP及正常膀胱黏膜组织中均见阳性表达，其RON mRNA/GAPDH mRNA比值分别为4.9×10-3(1.8×10-3 ～1.0× 10-2)、3.8×10-3（2.4×10-3～1.7×10-2）、4.9×10-3（1.7×10-3～1.1 ×10-2）、1.0×10-3(4.5×10-4 ～2.8×10-3)，且不同组织间的表达差异均有统计学意义(x2K-W= 17.278，P＜0.05)；RON mRNA/GAPDH mRNA比值在TCCB病理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别为3.7×10-3(1.3×10-3 ～7.5×10-3)、4.9×10-3（1.9X10-3～1.1 ×10-2）、8.9×10-3(2.7×10-3～8.0×10-2)，且差异有统计学意义(x2K-W=7.341,P＜0.05)；RON mRNA/GAPDH mRNA比值在TCCB临床Tis+ T1、T2 +T3 +T4期分别为3.5×10-3（1.2×10-3 ～7.7×10-3）、9.7× 10-3（2.9×10-3～5.3 ×10-2），差异也有统计学意义（Z= -2.306,P＜0.05）。但正常膀胱黏膜组未发现RON mRNA变异体，而在膀胱肿瘤组织中外显子11剪切缺失(E11△)的阳性表达率为70％( 55/79)。在TCCB、IPB、PUNLMP中E11△阳性表达率分别为71％ (45/63)、57％ (4/7)、67％ (6/9)，而不同病理组织中的E11△阳性表达率差异无统计学意义(x2=0.620,P＞0.05)；在不同TCCB病理分级和临床分期中其阳性率差异亦无统计学意义（Z值分别为0.221、0.538，P均＞0.05）。发现1种正常黏膜组织中没有的新变异体，即RON基因外显子的3 476～3 539 bp剪切缺失形成的变异体(E3 476 ～3 539△)。膀胱肿瘤组织中E3 476～3 539△的阳性表达率为56％ (44/79)，在TCCB、IPB、PUNLMP中E 3 476 ～3 539△的阳性表达率分别为57％( 36/63)、43％ (3/7)、56％ (5/9)，但各病理组织间的阳性率差异无统计学意义(x2=0.517，P＞0.05)；在TCCB不同病理分级和临床分期中其阳性率分别为40％ (12/30)、67％ (10/15)、78％ (14/18)、48％(21/44)、80％ (12/15)，差异有统计学意义（Z值分别为7.285、5.041,P均＜0.05）。结论 RONmRNA的表达与TCCB病理分级及临床分期相关，RON可能在TCCB发生发展的过程中发挥重要作用；在正常膀胱黏膜中未见RON mRNA剪切形成的变异体，而在膀胱肿瘤组织中都有不同程度的表达；E 3 476～3 539△的表达与TCCB病理分级及临床分期相关，RON mRNA变异体可能参与了膀胱肿瘤的发生。

糖皮质激素敏感型与抵抗型患者GRα、GRβ及SRp30c mRNA表达水平

糖皮质激素(以下简称激素)是临床上治疗许多慢性炎症性疾病的首选药,它通过与激素受体(GR)结合而发挥药理作用,但有部分激素抵抗型患者对激素治疗不敏感,其发病机制目前尚不清楚.人的细胞中存在两种GR亚型--GRα和GRβ.国内外许多研究表明,激素抵抗的发生与GRβ表达异常增多有关[1-3].近来又有研究提示,富含丝氨酸/精氨酸蛋白家族(SR蛋白家族)成员SRp30c在促进正常人中性粒细胞GR pre-mRNA发生选择性剪接形成编码GRβmRNA的过程中发挥重要作用[4].本研究通过检测激素抵抗型和激素敏感型患者外周血单个核细胞(PBMC)中GRα、GRβ及SRp30c mRNA的表达水平,探讨激素抵抗的可能发病机制.

HLA-G及其临床意义的研究进展

HLA-I类分子由经典的HLA-Ia(HLA-A、B、C)和非经典的HLA-Ib(HLA-E、F、G)构成.其中HLA-G作为一种非经典的MHC～Ⅰ类分子与经典的MHC-Ⅰ类分子相比,具有以下特点:①限制性组织分布②低度多态性③原始转录产物经选择性剪接编码至少六种亚型,即四种膜结合型(HLA-G1、G2、G3、G4)和两种可溶型(HLA-G5、G6).由于HLA-G初主要发现在母体胎儿交界处表达,故对其在母体胎儿免疫耐受中的作用研究较多.但同时也为器官移植等方面的研究提供了新的启示,本文就目前国内外对HLA-G结构、生物学功能及其与肿瘤、器官移植之间关系等方面的研究作一综述.

血管内皮生长因子 A的选择性剪接与眼内新生血管的生成

眼内新生血管的生成是多种眼病致盲的重要原因.血管内皮生长因子A(VEGF-A)家族是促进眼内新生血管生成的关键因素,其通过调控病理性血管的发生和增加血管的通透性而起作用.VEGF-A依选择性剪接方式的不同,可形成2个蛋白家族,分别是具有促血管生成作用的VEGFxxx家族和具有抗血管生成作用的VEGFxxxb家族.VEGFxxxb家族蛋白在正常眼组织中均有表达,而在糖尿病性视网膜病变患者的眼组织中表达水平降低.VEGF165b是VEGFxxxb家族中早分离出来且研究为广泛的分子结构,其可以明显抑制视网膜前新生血管的生成,而对视网膜生理性血管的发生无抑制作用.随着对VEGFxxxb家族研究的逐步深入,选择性剪接调节VEGFxxx与VEGFxxxb两者之间的平衡,可作为糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等眼内新生血管性疾病的治疗新策略.

内源性MGF在IGF-Ⅰ Pre-mRNA选择性剪接中的作用

目的 利用CRISPR/Cas9敲除小鼠成肌细胞系C2C12机械生长因子(mechano-growth factors,MGF),研究MGF在IGF-Ⅰ pre-mRNA选择性剪接和C2C12增殖分化中的作用.方法 针对IGF-Ⅰ第五个外显子设计并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒,通过细胞转染并筛选出MGF发生移码突变的细胞株.采用RT-qPCR技术,检测这些细胞株MGF和IGF-IEa表达变化,以及细胞增殖和肌向诱导分化能力的变化.结果 成功构建了针对MGF的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并筛选出3株MGF移码突变细胞株.这些细胞株的MGF和IGF-IEa表达上升,细胞增殖活性减弱,在诱导分化过程中,肌细胞标志性基因myogenin、MGF和IGF-IEa表达升高.结论 内源性MGF敲除能够影响IGF-Ⅰ pre-mRNA的选择性剪接以及增殖分化能力.

CDC28蛋白激酶调节亚基2对卵巢癌A2780细胞丝足形成的影响及其机制研究

目的 探讨CDC28蛋白激酶调节亚基2(CKS2)对A2780细胞丝足形成的影响及其可能机制.方法 采用慢病毒介导的shRNA敲除A2780细胞的CKS2基因,显微镜下观察细胞丝足的变化;采用细胞划痕实验检测A2780细胞迁移能力的变化;采用real time PCR检测CKS2敲除对CDC42两种剪接变异体(CDC42-V1和CDC42-V2)表达的影响,以及不同卵巢癌标本中CKS2、CDC42-V1和CDC42-V2剪接变异体的表达情况.结果 CKS2表达抑制后,A2780细胞丝足明显减少,细胞迁移能力明显减弱(P＜0.05),CDC42-V1mRNA表达降低,而CDC42-V2 mRNA表达升高(P＜0.05).Real time PCR结果显示,卵巢癌组织标本中CKS2及CDC42-V1的表达高于对应的正常卵巢组织,而CDC42-V2的表达低于对应的正常卵巢组织(p＜0.05).结论 CKS2通过调控CDC42的选择性剪接而影响细胞丝足的形成,进而影响卵巢癌细胞A2780的迁移能力.