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转GmDREB1基因抗旱小麦对大鼠肠道菌群的影响
目的 通过动物试验观察转GmDREB1基因抗旱小麦对大鼠肠道菌群的细菌种类、数量的影响.方法 60只SD大鼠按性别、体质量随机分为3组:转基因小麦组(A组)、亲本小麦对照组(B组)和AIN-93对照组(C组),分别饲喂相应饲料12个月.无菌采集大鼠粪便样品,用于五种常见菌群的分离培养计数及变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析.结果 喂养饲料后,A组及B组雄性、雌性大鼠粪便中双歧杆菌、乳杆菌的数量均高于C组,差异有统计学意义(P＜0.05);试验前后,A组及B组大鼠粪便中常见菌群数差异无统计学意义(P＞0.05);A组与B组DGGE图谱的每条泳道的条带数目、多样性指数差异无统计学意义(P＞0.05).聚类分析结果显示,A组及B组样品的组间相似性较高,未出现明显分支.结论 未发现转GmDREB1基因小麦对大鼠肠道菌群有不利影响.
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川芎内生细菌DGGE分析条件的筛选与优化
目的:针对川芎内生细菌16S rDNA序列进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)适宜序列的筛选与电泳条件优化.方法:川芎内生细菌16S rDNA的V3区及V6 ～ V8区分别进行聚合酶链反应(PCR)及巢式PCR以获得各菌种的目标DNA序列.采用DGGE垂直电泳法优化凝胶变性梯度,时间间隔法优化电泳时间,并根据电泳效果对电压和电泳时间组合进行修正.结果:川芎内生细菌16S rDNA V6 ～V8区序列更能有效排除宿主植物DNA的干扰,获得更加丰富的内生细菌DNA序列.针对该区的DGGE佳分析条件为变性剂梯度55％ ～70％ (Gel 6％),电泳温度60℃,电压50 V,电泳时间16h.结论:利用该优化条件能有效分离川芎各内生细菌16S rDNA V6～V8区序列,为川芎内生细菌的群落结构PCR-DGGE分析提供可靠的技术基础,为其他药用植物内生细菌的菌群多样性分析提供参考.
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乌头叶面细菌、真菌DGGE分析条件的建立与优化
目的:筛选并优化适用于分析乌头叶面细菌、真菌多样性的变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验条件.方法:采用Touch Down-PCR技术扩增乌头叶面细菌16 S rDNA V3区域和真菌18 S rDNA～5.8 S rDNA序列,利用该扩增产物对乌头叶面细菌、真菌DGGE电泳条件进行优化.采用DGGE垂直电泳法筛选凝胶变性梯度,时间间隔法优化电泳时间.结果:乌头叶面细菌DGGE佳分析条件为变性剂梯度30％ ～65％ (Gel 10％),电泳温度60℃,电压120 V,电泳时间7h.乌头叶面真菌DGGE佳分析条件为变性剂梯度25％～45％ (Gel 8％),电泳温度60℃,电压120 V,电泳时间10 h.结论:利用以上优化条件能有效分离乌头叶面细菌16 S rDNA V3区及真菌18 S rDNA ～5.8 S rDNA序列,为乌头叶面细菌,真菌的群落结构PCR-DGGE分析提供可靠的技术支撑.
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丹参叶片内生真菌群落结构及其与有效成分相关性分析
以5个不同地域丹参为材料,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术和高效液相色谱法(HPLC)探究了不同产地丹参叶片内生真菌群落结构特征与有效成分积累规律,进一步分析了二者的相关性.结果表明5个不同产地的丹参叶片内生真菌群落结构与有效成分的积累量均存在一定的相似性和差异性,二者相关性分析显示一些内生真菌与丹酚酸B、咖啡酸等几种有效成分的含量极显著相关(P＜0.01).
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2型糖尿病患者维医分型及其口腔菌群多样性研究
目的 了解维吾尔医学热性糖尿病和寒性糖尿病人口腔菌群结构的多样性及其与健康个体的差别. 方法 对26例2型糖尿病患者进行维吾尔医学分型,其中15例为热性糖尿病患者,11例为寒性糖尿病患者.采集26例糖尿病患者和14例健康对照者的口腔细菌样品,提取细菌总DNA,PCR扩增16S rDNA V3可变区,产物经DGGE后借助Quantity One-4.6.8软件计数指纹图谱中每个样本的条带数,进行多样性分析. 结果 3组个体的DGGE指纹图谱DNA条带数分别为21.0±3.7、21.7±3.3和20.4±2.7,差异无统计学意义(P=0.36). 结论 热性糖尿病组和寒性糖尿病组患者口腔菌群与健康对照组具有同样程度的多样性.
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变性梯度凝胶电泳检测阴道菌群实验方法的建立及优化
目的 建立并优化应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测阴道菌群的技术路线. 方法 2011年5～6月在北京大学肿瘤医院妇科门诊就诊的16名成年女性,其中6名女性取阴道穹隆分泌物,10名女性分别取阴道中段和阴道穹窿部分泌物,提取阴道菌群总DNA,采用巢式聚合酶链式反应扩增细菌16S rRNA基因的V2-V3可变区,DNA扩增产物分别在30％～60％和40％～70％浓度梯度变性凝胶下进行DGGE. 结果 DGGE图像分析显示阴道中段和阴道穹窿分泌物阴道菌群构成相同,平均条带数为2.5,差异无统计学意义(P＞0.05).变性凝胶浓度梯度为30％～60％时,阴道菌群的DGGE图像中各条带较分散,易于条带识别和分析,但有部分条带电泳出凝胶范围;变性凝胶浓度梯度为40％～70％时,阴道菌群的DGGE条带密集但均较清晰. 结论 巢式聚合酶链式反应与DGGE相结合具有高效、快速、精确的特点,可用于阴道菌群检测.
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牙周牙髓联合病变菌群的PCR-DGGE分析
目的 利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术观察牙周牙髓联合病变患牙牙周组织和根管中原始菌群分布状况及其异同,并通过克隆测序技术来试图探讨两部位可能存在的优势菌.方法 从13例牙周牙髓联合病变患牙分别采集患牙根尖1/3处牙周细菌和根管牙髓细菌,提取细菌总DNA,扩增16S rRNA基因可变区,再进行变性梯度凝胶电泳.应用SPSS17.0软件和Quantity One软件对DGGE图谱菌种条带进行统计学分析和聚类分析.对DGGE凝胶中有代表性的条带进行回收和克隆测序.结果 两取菌部位的菌种条带数间有明显的统计学差异(P＜0.01),但二者之间无正相关性.二者间的相似系数为13.1％ ～62.5％.牙周牙髓联合病变患牙根尖区1/3处牙周菌属可能有弯曲菌属(Campylobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)等,该处对应根管中菌属可能有优杆菌属(Mogibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、放线菌属(Actinomyces)等.结论 牙周牙髓联合病变(牙周来源)中牙周组织和邻近根管牙髓组织中菌种在数目和结构上有明显不同.该病变牙周组织和根管中可能存在目前尚未被认知的优势菌种.
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逆转录-PCR-变性梯度凝胶电泳法检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症
目的 探讨逆转录-PCR-变性梯度凝胶电泳法(RT-PCR-DGGE)对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD缺乏症)进行分子诊断的可行性.方法 以硝基四氮唑蓝(NBT)G6PD/6PGD比值将患儿分为G6PD活性缺乏(60例)、不能确诊(51例)及G6PD活性正常值组(100例);外周血提取总RNA和逆转录成cDNA;针对中国人群已报道的17种突变位点,以cDNA为模板,分段设计6对DGGE引物,利用PCR-DGGE等方法在全编码区范围内分区段进行基因突变筛查及分型,并对各类突变型进行测序验证.结果 检出A95G、G392T、T517C、G871A、C1024T、C1360T、G1376T、G1388A 8个已知基因突变位点和1个新发现位点,G6PD缺乏组、不能确诊组及G6PD活性正常值组基因突变总检出率分别为88.3%、77.3%和14.0%.结论 RT-PCR-DGGE对G6PD缺乏组、不能确诊组的基因突变检出率较高,特别是对不能确诊组杂合子检出具有重要临床意义.
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乙型肝炎肝纤维化患者肠道菌群结构及血清代谢谱的改变
目的 探讨乙型肝炎肝纤维化患者肠道微生态特点及血清代谢谱的改变.方法 选择2011年1月至2012年12月就诊于浙江省金华市中心医院的30例肝纤维化患者和100名健康人作为研究对象.采集所有研究对象的新鲜粪便和血液样本各1份.运用聚合酶链反应(PCR)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对粪便样本进行检测并生成16S rDNA V3可变区基因的DGGE图谱,然后用Matlab 7.0软件进行主成分分析,以寻找两组肠道微生态图谱差异.血液样本采用1H磁共振技术检测与分析两组血清代谢物图谱的差异.结果 对粪便样本进行PCR-DGGE检测和主成分分析,结果显示,与健康人群相比,乙型肝炎肝纤维化患者肠道主要菌群结构发生了明显变化.血清代谢图谱分析显示:肝纤维化组和健康对照组的血清代谢谱完全不同,肝纤维化患者血清代谢物中乳酸、蛋氨酸、三甲胺和葡萄糖明显升高.结论 肝纤维化患者肠道总菌群结构及代谢产物与健康人之间有明显差异.
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结直肠癌患者腹腔镜根治术前后肠道菌群的变化研究
目的 研究结直肠癌患者腹腔镜根治术前后肠道菌群的变化.方法 选择2016年6月到2017年12月收治的结直肠癌患者46例作为结直肠癌组,选择同期健康体检者46例为健康体检组.纳入患者均行腹腔镜根治术,在术前、术后分别采集一次新鲜粪便,测定采集粪便中肠道菌群DNA情况,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳测定患者手术前、后肠道菌群情况,根据测定结果绘制相应的图谱,分析手术前、后肠道菌群的变化情况.采用SPSS18.0软件处理,肠道菌群的多样性及丰富度采用(x-±s)表示,采用配对t检验或F检验,P<0.05差异有统计学意义.结果 对粪便进行PCR扩增,获得的肠道菌群各带均处于200 bP左右,与预期的DNA片段长度相吻合;健康体检者粪便标本多样性指数(H)为(5.6±0.2),丰富度(E)为(77.1±0.4)条;结直肠癌患者术前粪便标本多样性指数(H)为(3.8±0.1)、术后为(4.1±0.1),术前丰富度(E)为(45.3±0.9)条、术后为(50.6±0.6)条,术后肠道菌群多样性及丰富度比术前增加(P<0.05),但仍低于健康体检组(P<0.05).肠道菌群的多样性及丰富度与患者的年龄、临床分期有关(P<0.05),与性别、病程、肿瘤类型无关(P>0.05).结论 正常人肠道菌群的多样性及丰富度较结直肠癌患者高,其与患者的年龄、临床分期有关.临床通过肠道菌群变化分析有助于指导临床治疗.
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高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术
目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.
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机械通气新生儿气管导管表面生物膜细菌多样性研究
目的 观察机械通气新生儿气管导管表面生物膜细菌群落多样性,探讨以变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术为基础的细菌鉴定方法与传统培养法的差异,为临床预防、诊疗细菌性感染提供新思路.方法 以重庆医科大学附属儿童医院新生儿中心2011年10月至2012年3月经治的26例患儿35根气管导管为研究对象,依靠16S rDNA PCR-DGGE技术,通过quantity one软件分析气管导管表面生物膜中细菌群落多样性,通过T-A克隆测序,了解生物膜中细菌种类分布及常见优势菌.结果 35根气管导管经16S rDNA PCR-DGGE所得条带13.8±5.4,香农威纳指数2.42 ±0.38.16份标本来自7例患儿不同疾病阶段,其中6例患儿气管导管留置天数增加,香农威纳指数减小.6例不同基础疾病患儿的气管导管标本香农威纳指数各不相同.回收24条优势条带克隆测序.35份标本中检出克雷伯菌属100％、假单胞菌属80％、链球菌属77％,91％的标本中存在无法培养的细菌,97％检测到2种以上菌属.80％克雷伯菌属和82％链球菌属中分别与假单胞菌属伴随存在.22例有临床痰培养结果,肺炎克雷伯菌10例(45％),鲍曼不动杆菌2例(9％),阴沟肠杆菌、阴性结果各1例(5％),培养结果均为单菌属.8例痰培养显示“正常菌群”,其对应导管上均检测到克雷伯菌等菌属.结论 气管导管表面生物膜中细菌群落具有多样性；16S rDNA PCR-DGGE技术相比培养法更能全面反映气管导管表面细菌群落组成和多样性；克雷伯菌属、假单胞菌属及链球菌属是气管导管表面生物膜中常见菌属,它们在生物膜形成过程中可能存在相互作用.
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急性下颌智牙冠周炎菌群结构变性梯度凝胶电泳分析
目的 应用变性梯度凝胶电泳技术,分析急性下颌智牙冠周炎菌群结构.方法 采集29例急性下颌智牙冠周炎盲袋内细菌标本,提取细菌总DNA,巢式聚合酶链反应扩增全部细菌16S rDNA基因V2-V3可变区.变性梯度凝胶电泳对PCR扩增产物进行分离.应用BioNumerics软件对DGGE图像资料进行聚类分析,对比不同类别样本中的临床资料、条带数量和条带模式.结果 29例急性下颌智牙冠周炎细菌16S rDNA基因条带数量和条带模式存在不同.通过聚类分析可将临床样本聚为2组,2组间临床资料的差异没有统计学意义;但条带数量和相似系数均不同,差异具有统计学意义.结论 急性下颌智牙冠周炎临床状态基本相同,而菌群结构不同.DGGE技术和聚类分析可用于急性下颌智牙冠周炎细菌菌群结构的研究.
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乳牙急性根尖周脓肿细菌的DGGE分析
菌27.3%,弯曲菌27.3%,密螺旋体27.3%,布雷德菌27.3%.结论 乳牙急性根尖周脓肿细菌存在个体差异,某些特定细菌以较高频率存在.细菌16S rRNA基因 PCR-DGGE,切胶,克隆测序方法除检测出培养法检出的细菌外,还检出难培养的和未预料到的细菌.
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老年根面龋牙菌斑细菌组成的聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析
目的 研究老年人根面龋牙菌斑内细菌群落构成,以期为今后深入研究根面龋的病因提供依据.方法 提取9例60岁以上根面龋患者9颗患牙的牙菌斑细菌DNA,应用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳( PCR-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术扩增,克隆、测序并与核酸序列数据库进行比对,鉴定优势菌属种类.结果 老年人根面龋牙菌斑中共检测到114个细菌基因型,分属于不动杆菌属[0.9％ (1/114)]、放线杆菌属[1.8％ (2/114)]、放线菌属[15.8％( 18/114)]、Aggregatibacter菌属[0.9％(1/114)]、二氧化碳嗜纤维菌属[14.0％ (16/114)]、棒状杆菌属[0.9％ (1/114)]、嗜血杆菌属[0.9％ (1/114)]、动弯杆菌属[0.9％ (1/114)]、纳西杆菌属[0.9％(1/114)]、奈瑟球菌属[10.5％ (12/114)]、卟啉单胞菌属[0.9％ (1/114)]、普氏菌属[12.3％(14/114)]、新月单胞菌属[6.1％ (7/114)]、葡萄球菌属[1.8％ (2/114)]、口腔链球菌群[6.1％(7/114)]和变异链球菌群[7.9％ (9/114)]、Tannerella菌属[0.9％ (1/114)]、密螺旋体[1.8％(2/114)]和韦永球菌属[10.5％ (12/114)],以及两例未获培养的不知名菌种[1.8％ (2/114)].未获培养的基因型占总数的19.3％(22/114).革兰阳性细菌的基因型占31.6％(36/114),革兰阴性细菌的基因型占66.7％ (76/114).结论 老年人根面龋牙菌斑中细菌基因型多且分布较广,以革兰阴性菌占多数；未发现特异性致龋细菌基因型.
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变性梯度凝胶电泳分析氟化泡沫对牙菌斑微生物的影响
目的 观察临床应用1.23％氟化泡沫对儿童牙面菌斑微生物组成的影响.方法 选取北京市海淀区幼儿园的10名学龄前儿童,平均年龄3.7岁；常规口腔检查,记录龋失补牙面数；样本采自1.23％氟化泡沫干预前后1个月内不同时间(基线及涂氟后第1、2、3、4、7、10、15、21、30天)相同牙面的菌斑；应用PCR-变性梯度凝胶电泳技术表达菌斑微生物DNA图谱,通过GelComparⅡ分析软件解析菌斑微生物的群体相关性,采用Mann-Whitney U检验分析微生物多样性指数(ShannonWeiner指数),通过聚类统计分析样本微生物群落不同时间点的相似性及种群聚类分析.结果 10名儿童基线菌斑微生物DNA的条带数为26.9±2.9,使用氟化泡沫干预3d后菌斑微生物DNA条带数下降至20.1 ±3.8,与基线相比差异有统计学意义(P＜0.05)；Shannon-Weiner指数在基线为3.18±0.31,干预3d后为2.92 ±0.28,二者差异有统计学意义(P=0.04).10名儿童的微生物电泳图谱戴斯系数(Dice coefficient)和个体微生物群落聚类分析表明,氟化泡沫干预后菌斑微生物种群结构发生变化,但1个月后菌斑结构与基线相似.结论 1.23％氟化泡沫对儿童牙面菌斑微生物在一定时间内有明显的抑制作用；应用氟化泡沫后菌斑微生物种群结构经历了复杂的变化后还能恢复至原有状态.
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老年高血压患者唾液微生物群落初步研究
目的:利用PCR-DGGE指纹图谱技术对老年高血压患者口腔唾液微生物群落结构进行初步研究.方法:在65-80岁老年人中采集高血压伴慢性牙周炎患者、全身健康慢性牙周炎患者、口腔健康高血压患者和健康对照4组人群唾液,提取细菌总DNA,扩增后经DGGE指纹图谱分析其微生物多样性.结果:高血压伴慢性牙周炎患者与口腔健康高血压患者和健康对照组相比,其唾液微生物群落的丰富度(S)和Shannon指数(H')显著降低(P＜0.05).结论:菌群失调是老年高血压患者牙周炎发生发展的关键因素,良好的血压控制和口腔卫生保健是促进老年高血压人群口腔健康及全身健康的重要保障.
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利用DNA指纹图谱技术对健康女性阴道菌群多样性的分析
目的:利用DNA指纹图谱技术——变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)分析我国育龄期及绝经期健康女性阴道菌群多样性,为了解各种下生殖道感染疾病状态下的微生态环境奠定基础,为研制适合恢复中国女性正常阴道微生态环境的微生态制剂提供依据.方法:选取2009年10月至2010年1月在北京大学第一医院妇产科门诊常规体检的健康女性(其中育龄期30例、绝经后30例)为研究对象.采集阴道分泌物,提取细菌总DNA,采用通用引物对细菌16S rDNA基因的V3区进行扩增,将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳,通过对DGGE特征条带切胶回收并进行克隆测序,利用GenBank中的Blast与已知序列比对,鉴定细菌菌种,分析不同生理状态下阴道菌群的多样性.结果:(1)我国育龄期健康女性阴道常见菌种为:卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)和加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri),其中惰性乳杆菌是以往通过传统培养方法尚未认识到的阴道优势菌种.(2)绝经期健康女性阴道菌种与育龄期不同且复杂,常见菌种有:惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)、韦荣球菌属(Veillonella sp.)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、咽颊炎链球菌(Streptococcus anginosus)、普雷沃氏菌属(Prevotella sp.)、气球菌(Anaerococcus lactolyticus)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis).结论:通过DGGE分析发现我国育龄期健康女性阴道常见优势菌种为:卷曲乳杆菌、惰性乳杆菌、加氏乳杆菌；绝经期健康女性阴道常见优势菌种为:惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、大肠杆菌、链球菌属、普雷沃菌属、脆弱拟杆菌以及产乳酸的韦荣球菌、气球菌属,并首次发现在不同生理状态下惰性乳杆菌均是阴道优势菌种之一.
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苏云金菌杀蚊新基因和菌株的筛选
目的测定杀蚊毒素cry 4与cyt基因的分布,并检出其未知的基因.方法从基因库中找出并比较全部cry 4与cyt基因的DNA序列,根据其共有和特有的片断,设计出相应的引物.用这些引物扩增的PCR产物被变性梯度凝胶电泳分析,排除从已知的cry 4与cyt基因扩增出来的PCR片断而检出未知基因的PCR片断.结果总共测出从未报道过的cry 4与cyt基因在杀蚊苏云金杆菌的分布44个.并发现8个可能的新的cry 4和cyt基因.它们是cry 4Ab,cry 4Ac,cry 4Bb,cyt 1Ac,cyt 2C,cyt 1相关基因,苏云金杆菌亚株medellin特异性cyt 1基因,亚株jegathesan特异性cyt 2基因.结论根据该实验结果和以前的报告,将杀蚊苏云金杆菌分为3组.其中,苏云金杆菌亚株jegathesan可作为亚株israelensis的替换菌株,以避免蚊虫的耐药性.
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葛根芩连汤对KK-Ay糖尿病小鼠血浆中LPS、TNF-α、IL-6及肠道菌群的影响
目的 探讨葛根芩连汤(GGQLD)对KK-Ay糖尿病小鼠血浆中脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)的量及肠道菌群的调节作用.方法 以普通饲料喂养的C57BL/6J小鼠作为对照组,ig等量蒸馏水.将高脂饲料喂养的KK-Ay小鼠分为5组,吡格列酮组和模型组分别ig给予盐酸吡格列酮5 mg/kg和等量蒸馏水,GGQLD高、中、低剂量组ig分别给予GGQLD生药40、13.3、4.44 g/kg.各组均连续给药4周后,以鲎试剂显色基质法测定血浆中LPS的量,用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测血浆中TNF-α及IL-6的水平,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析小鼠肠道菌群的结构.结果 与模型组相比,GGQLD高、中剂量组均能显著降低小鼠血浆内LPS的量(P＜0.05),分别降低了15.61％、14.48％;GGQLD高、中、低剂量组IL-6的量与模型组比较分别下降了56.86％、37.12％、30.21％,具有一定的剂量依赖性,且有统计学意义(P＜0.05);GGQLD高、中、低剂量组TNF-αt的量均明显低于模型组(P＜0.05),分别下降了28.32％、30.70％、23.42％. GGQLD高剂量组DGGE图谱条带数目明显增多,且经克隆、测序和Blast比对分析,约翰逊氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii为GGQLD高剂量组特有,说明GGQLD可明显调节肠道菌群结构.结论 GGQLD抗2型糖尿病胰岛素抵抗作用可能与其改善LPS、TNF-α、IL-6等炎症因子,及调节肠道菌群结构相关.
