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乙肝病毒衣壳作为肝癌基因转移载体的有效性检测
乙型肝炎病毒(HBV)的嗜肝性主要是由于衣壳上镶嵌的外衣壳蛋白PreS1(21~47 区段)与肝细胞膜表面的HBV受体结合而引起,因此利用此生物学特性有可能将HBV改造成肝癌靶向性基因转移载体.
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椎间盘组织工程研究进展
1999年,Nishida等[1]报道以携LacZ标志基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)注射入兔髓核内,实现了目的基因的表达.此前的研究显示,携hTGF-β1基因的重组腺病毒(Ad-hTGFβ1)直接椎间盘内注射也可在体内高表达并使椎间盘内的蛋白多糖合成增加[2].此后,众多的基因转移载体被构建并应用于椎间盘退变的基因治疗研究,其中以腺病毒和逆转录病毒载体为常用.
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肝干细胞作为肝癌靶向基因治疗载体的体内实验研究
肝癌基因治疗作为现代分子药物治疗,为肝癌的治疗带来了新的前景,但目前肝癌基因治疗的研究结果尚不能令人满意,缺乏良好的基因转移载体是其重要原因[1],改进现有思路,提供一个靶向肝癌细胞的新的基因转移策略十分必要.
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聚酰胺-胺型纳米载体在基因治疗中的研究现状及展望
一种新型纳米材料--聚酰胺-胺型(polyamidoamine,PAMAM)树枝状高聚物(dendrimers),以下简称PAMAM-D,为放射状对称的球形多聚体,是近各学科中研究热点之一.尤其应用PAMAM-D作为基因转移载体取得成功令人鼓舞.PAMAM-D表面主要为胺基团,具有结合、浓缩DNA及将DNA高效导入各种细胞的能力,体外显示无明显细胞毒性.已有应用PAMAM-D转移寡核苷酸、反义寡核苷酸及寡核苷酸探针的系列报道.同时动物实验结果提示,使用无免疫原性的PAMAM-D可获取有效基因转移率.
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心血管疾病基因治疗研究中基因转移载体的生物安全性探讨
多种心血管疾病包括缺血性心肌病、动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭等,可以采用基因治疗获得较好疗效。然而,心血管病基因治疗与其他疾病的基因治疗一样,在世界范围内还处在试验阶段。对心血管疾病进行基因治疗,需高效的基因转移载体和转移体系将目的基因导入心血管,并安全可靠地表达。基因治疗载体的选择是决定基因治疗是否有效的重要因素之一。理想的基因转导载体应该无致病性、可以有效转导靶细胞,转基因可以整合到宿主基因组,长时间稳定表达并可调控,同时只有小程度的副作用[1]。在用基因治疗纠正疾病缺陷时,其安全性研究及评价也就成为人类迫切需要解决的问题,生物安全性一直以来都是人们在构建基因治疗载体时所关注的重要问题。目前,应用于基因治疗的载体主要可分为病毒载体和非病毒载体。
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癌基因治疗中的腺病毒载体的开发和应用(综述Ⅰ)
在基因治疗中,理想的基因转移载体应具备如下的条件:(1)基因转移效率高.(2)容量大.(3)选择性基因转移.(4)受控制的细胞毒性.(5)受调节的免疫原性.(6)易于构建和操作.(7)费用低.(8)安全且易于应用.(9)可被医生及患者接受.
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慢病毒载体及其在基因治疗中的研究进展
基因治疗作为一种相对理想、高效、特异的治疗手段,已成为目前生命科学领域重要的研究之一.如何选择一个合适的基因转移载体,是基因治疗的一个重要方面.目前,病毒载体的应用非常广泛.包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等.本文拟就慢病毒载体系统及其在基因治疗中的应用和研究进展作一综述.
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杆状病毒早期启动子载体的构建及报道基因的表达
目的:用苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)的IE 1基因启动子构建杆状病毒早期基因启动子载体。方法:以AcNPV p10基因为侧翼序列,并将新霉素抗性基因(neo)插入IE 1基因启动子下游,得到转移载体pAcPIneo。将它和野生型AcNPV DNA共转染昆虫细胞Sf9,由于neo基因的表达,通过G418的选择和富集作用,得到重组病毒vAcPIneo的纯培养。结果:用酶切和Southern印迹杂交证明,neo基因整合于AcNPV基因组的p10基因位相。结论:成功地构建了杆状病毒早期启动子载体,neo基因在受染细胞内从早期到晚期均可发生转录。
关键词: 昆虫杆状病毒 IE1基因 p10基因 转移载体 新霉素抗性基因(neo) -
杆状病毒/哺乳动物基因转移载体应用于活载体疫苗研究的进展
近年,高致病性禽流感、猪链球菌等动物疫病频繁暴发流行,不但对畜牧业生产造成巨大经济损失,而且给人民健康带来严重威胁.因此,如何研制并利用安全、有效的基因工程疫苗对预防和控制人兽共患传染病的发生和流行意义重大.
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厌氧菌作为肿瘤基因治疗转移载体的研究进展
实体瘤内存在低氧坏死区域,故可利用具有趋低氧特性的厌氧茵作为肿瘤基因治疗的转移载体。研究表明厌氧茵作为基因载体肿瘤靶向性较强,且使用较安全,是一种新型的基因治疗转移载体。现综述厌氧菌作为肿瘤基因治疗转移载体的研究进展。
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含抑癌基因p16转移载体的构建
目的:为获得高表达有活性的p16蛋白,构建含p16 cDNA的重组转移载体.方法:EcoRI-xhoI双酶切克隆质粒pBLUESCRIPT-p16,低融点琼脂糖回收0.8kb的p16 cDNA片段,插入质粒pSXIVVI+X3,构建含p16的重组载体pX3-p16,并对重组子以菌落原位杂交和酶切电泳两种方法进行鉴定.结果:电泳证实低融点琼脂糖回收的片段为0.8kb.菌落原位杂交筛选8个阳性克隆,酶切电泳证实阳性克隆中p16 cDNA插入方向正确.结论:成功构建了含p16 cDNA的重组转移载体,为p16在昆虫细胞和活体昆虫中的表达奠定了基础.
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表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建
用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDV CVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒.将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2).用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.
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含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达
根据已发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK(+)载体中,筛选出阳性载体pBUS10.用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3 载体中,构建出在CMV启动子和增强子控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3.转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因.
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非病毒载体研究进展
基因治疗面临的主要挑战是研制安全、靶向、高效、无免疫原性、规模化制造和纯化、价廉的基因转移载体.常用的病毒载体,虽经遗传工程改造,去除了病原性而保留了基因转染效能,但制备困难、目的基因插入长度受限,还存在潜在的免疫反应和生物安全等问题.非病毒载体大多制作简单,免疫反应低,不与宿主基因组整合,可重复应用,克隆能力不受限,其独具的优点正吸引越来越多的研究注意[1,2].
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基因重组疫苗的研究进展
血凝素是流感的保护性抗原,它不仅诱导机体产生针对血凝素1和血凝素2的抗体,而且诱导CTL反应.1.2.1 左青山等[1]构建了禽流感(AIV)血凝素5和血凝素9基因共表达禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的血凝素基因重组禽痘病毒,可表达AIV的血凝素5和血凝素9基因.用该重组禽痘病毒免疫鸡后再用禽流感病毒做攻击试验,结果表明该重组病毒能全面诱导机体的细胞免疫和体夜免疫反应,对H5强毒攻击产生强的免疫保护,为进一步开展疫苗研究奠定科学的理论和实验基础.
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重组人β-防御素-2基因在昆虫细胞的转染表达
目的:BEVS(Baculovirus expression vector system)杆状病毒表达系统是近年涌现的适用范围广、表达效率高的真核表达系统之一.本研究旨在探索应用该系统高效表达hBD-2的可行性及技术路线.方法:(1)利用引物hBD2p6和hBD2p9经PCR扩增,从原质粒的pcDNA3.1/Myc-His(+)/hBD-2中扩增出带有翻译起始密码ATG和终止密码TGA的完整重组hBD-2/His基因片段,通过双酶切,使该片段两端分别带有ScaI和KpnI两种限制性内切酶粘性末端;将此外源性片段插入转移质粒pAcGHLT-A的多克隆位点中的ScaI和KpnI位点上,使其处在多角蛋白基因强启动子的控制之下.(2)经重组pAcGHLT-A/hBD-2/His转移载体和AcNPV DNA共转染Sf21细胞,并在细胞内进行同源重组,形成重组病毒rAcNPVhBD-2/His.于共染后第5 d,收集各组细胞的培养上清,用终点稀释分析法检测共转染效率.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞和终点稀释分析法验证,获得高滴度的重组病毒.(3)用特异性抗-His抗体,经Western blot检测细胞及上清hBD-2/His的表达情况.结果:经酶切鉴定和测序分析证实:C端带Myc和6个多聚组氨酸双重标志的重组hBD-2已正确地插入BEVS系统的转移载体中,构建成重组转移载体pAcGHLT-A/hBD-2/His.经过多轮感染上清反复感染Sf21细胞及终点稀释分析法验证,高滴度的重组病毒rAcNPVhBD-2/His已被获得.Western blot检测结果提示Sf21细胞已表达和分泌6xHis-GST-hBD-2-6xHis融合蛋白.结论:本研究结果支持利用BEVS杆状病毒-昆虫表达系统作为高效表达重组hBD-2生物反应器的设想.
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腺相关病毒载体与中枢神经系统疾病的基因治疗
中枢神经系统疾病分子改变的深入研究和基因治疗技术的不断发展为临床治疗这些疾病带来了希望.但基因治疗临床应用的大障碍之一便是转基因技术中载体系统的选择.理想的体内基因转移载体应具有较好的细胞靶向性,目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行.自七十年代末病毒载体的概念提出以来,用于基因治疗研究的缺陷性病毒载体种类日渐增加,应用也愈加广泛.其中,腺相关病毒(AAV)载体是目前病毒类转基因系统中较新的成员.由于该系统大的优点之一是它的安全性较好,并且有可能发展成为将外源基因整合入宿主细胞染色体的非病毒载体系统,因此倍受关注,并已开始应用于临床试验[1].
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丙型肝炎病毒H株包膜糖蛋白在昆虫细胞中的表达
[付莉,徐志凯,汤丽霞,薛小平,尹文 . 细胞与分子免疫学杂志,2001;17(4):337-339] 目的利用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞中表达了丙型肝炎病毒(HCV)H株的包膜糖蛋白E,并应用表达产物对HCV感染患者血清中抗膜蛋白抗体进行检测. 方法将HCV H株E基因片段克隆到杆状病毒转移载体上,转染昆虫细胞,表达包膜糖蛋白,经免疫杂交法鉴定表达产物,并用细胞间接免疫荧光法检测患者血清抗膜蛋白抗体的水平. 结果 Western blot显示,表达产物中有多条分子量不同、可与HCV RNA阳性血清反应的蛋白. 细胞免疫荧光染色表明,HCV包膜糖蛋白在细胞浆中表达.用表达产物分别检测HCV患者血清,发现仅11.4%血清中含有膜抗体. 结论成功利用昆虫细胞表达了HCV包膜糖蛋白,为HCV疫苗的研究奠定了基础.(何扬举)