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马立克氏病毒meq基因缺失株SC9-1通过自然重组获得meq能力的分析
为了探究meq基因缺失的马立克氏病毒疫苗株SC9-1与超强毒株Md5是否能够通过自然重组获得meq基因的能力,将SC9-1疫苗毒和Md5超强毒共同感染鸡胚成纤维细胞(CEF),并在CEF上连续传三代,提取单个蚀斑的病毒DNA.同时将Md5超强毒接种免疫过SC9-1疫苗株的SPF鸡,在不同的时间点分离病毒,提取单个蚀斑的病毒DNA.将两种方式获得的病毒DNA进行PCR验证,并将香啤酒重组酶位点(FRT)残留序列克隆测序,比较其同源性.两种方式鉴定的病毒均为SC9-1或是Md5,没有检测到重组病毒,而且FRT残留序列同源性为100％.结果SC9-1没有从野生毒株Md5获得缺失的meq基因,而且meq基因敲除区具有很好的遗传稳定性.
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一株具有急性致瘤特性的马立克氏病病毒的分离与鉴定
应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从免疫过CVI988/Rispens疫苗株患马立克氏病(MD)的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV)(命名为YL040920株).从该分离株蚀斑克隆获得的9个克隆在蚀斑形成时间及其形态大小上均无明显差别,表明它较为单一;应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,发现其序列具有MDV-1强毒株的特征;用基于抗MDV-1 MEQ蛋白的单克隆抗体3G12E6的免疫荧光试验(FA)对毒株的DEF培养物进行检测,发现有特异性的荧光定位于细胞核内;应用毒株感染霞烟鸡,早在接种后(PI)21d即可诱发明显的内脏器官,在各器官肿瘤中以心脏、肝脏和皮肤的肿瘤发生率高;用禽肿瘤病三重PCR鉴别诊断技术对毒株的DEF培养物以及感染鸡的内脏器官组织进行检测,均能扩增到MDV-1强毒株的特异性带,而网状内皮增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)的检测则均为阴性.研究的结果表明,分离株YL040920为单一的MDV-1强毒株,无REV、ALV以及疫苗株CVI988/Rispens的混杂,并具有以心脏、肝脏和皮肤肿瘤为主的急性致瘤特性.
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一株整合有禽反转录病毒长末端重复序列的马立克氏病病毒野毒株的致病性研究
使用从发生马立克氏病(Marek's disease,MD)肿瘤的病鸡中分离的整合有禽反转录病毒长末端重复序列的马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)GXY2株进行鸡的致病性试验.将试验鸡分成A、B、C、D和E共5组,B～E组鸡在1日龄接种MDV疫苗,其中B和D组鸡接种CVI988/Rispense株,C和E组鸡接种HVT株冻干疫苗,A组为未免疫组.在试验鸡8日龄时,A、B和C组鸡用GXY2株进行腹腔攻毒,D和E两组为未攻毒组.全部试验鸡均按常规方法饲养直至攻毒后(PC)82 d.记录和解剖试验期间死亡的鸡以及试验结束时剖杀的全部幸存鸡,检查肉眼可见MD肿瘤病变并应用已建立的禽肿瘤PCR鉴别诊断技术进行验证.结果表明:A、B和C组鸡早因MD肿瘤而死亡的时间分别在攻毒后第25 d、77 d和29 d;在攻毒后82 d,前述三组鸡中的MD肿瘤发生率分别为72%、34.8%和50%,死亡率分别为84%、21.7%和20%CVl988/Rispense株和HVT株对GXY2株攻击的保护率分别为51.67%和30.56%;在全部试验鸡的各种内脏器官中,以心脏的MD肿瘤发生率高(23.5%),其次是肝脏(14.7%)和肌胃(10.3%);GXY2株可以显著抑制未免疫鸡的增重并导致其胸腺和法氏囊严重萎缩.本试验的结果表明,GXY2分离株具有快速致瘤特性,并且可以突破疫苗株HVT和CVI988/Rispense提供的免疫保护.
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鸡马立克氏病病毒流行毒株高代次细胞毒株Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因变异分析
根据鸡马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)GA株的全基因组序列,设计合成了用于扩增MDV Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因的引物,分别扩增4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株(L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C)及相应亲本毒株(L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY)、MDV强毒J-1株、81 4疫苗株等10个毒株的Meq、RLORF4、RLORF1 2和132bpr基因.经克隆测序后,分析4个高代次细胞毒株中相应基因的变异,并与MDV强毒J-1株、814疫苗株及GenBank中已发表MDV毒株的相应序列进行比较.序列比对分析发现,L-CZp75C株Meq基因的第625位存在碱基C插入突变;L-ZYp75C株Meq基因第529位存在碱基C插入,且第602位缺失碱基T,从而致使Meq基因推导的相应氨基酸序列在第177～200位发生移码突变.L-SYp85C株RLORF4基因在第215～265位缺失51bp,致使该基因推导的氨基酸序列相应缺失17个氨基酸残基.分析RLORF12基因序列,发现L-MSp75C株在第67位存在碱基T缺失,814疫苗株在第18～86位缺失69 bp,缺失位置均位于复制起点(Origin of replication,Ori)内;而L-ZYp75C毒株在RLORF12基因第168～174位存在独特的TGTTGGG碱基缺失.4个细胞高代次毒株的132 bpr基冈的扩增结果表明,该基因在病毒基因组中的拷贝数明显增加,可达到10个拷贝以上.上述分析结果提示,4株MDV流行强毒株经体外连续传代后,MDV致瘤相关基因Meq、RLORF4、RLORFl2和132bpr基因等发生了缺失突变或插入突变.
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马立克氏病病毒可感染鸡大脑小胶质细胞并促进其Toll样受体15和1LB基因的转录
体外培养雏鸡大脑神经胶质细胞并纯化得到小胶质细胞.分别用马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)广西超强毒力(vv)株YL040920和弱毒疫苗株CV1988/Rispens感染小胶质细胞,每日观察病毒感染后的细胞病变效应(CPE);用免疫组织化学法检测病毒感染后小胶质细胞中MDV MEQ蛋白的表达,并用荧光定量PCR(qPCR)以及qRT-PCR法分别检测MDV meq基因(meq-DNA)的复制以及gB基因mRNA(gB-mRNA)的转录水平.同时用qRT-PCR法检测MDV感染对小胶质细胞Toll样受体家族(TLRs)基因转录的影响.结果发现,YL040920株和CV1988/Rispens株病毒均能感染小胶质细胞,病变细胞呈多灶性脱落并形成空斑,随病变进展迅速增大并融合.可在MDV感染的小胶质细胞核内检测到MEQ蛋白,并在感染细胞中检测到meq-DNA的复制和gB-mRNA的转录.YL040920株感染的小胶质细胞中病毒载量和gB-mRNA的转录水平显著低于以相同病毒量CV1988/Rispens株感染的小胶质细胞中的相应量(P≤0.05/0.001).MDV感染可上调小胶质细胞TLR15和TLR1LB基因的转录水平.小胶质细胞中TLR15和TLR1LB mRNA的转录水平在YL040920感染1 d后升高,于3 dpi达到高值,到5 dpi时有所降低.检测到小胶质细胞中TLR1LB mRNA转录水平在CV1988/Rispens感染1 d后升高,到3 dpi时达高值;而TLR15 mRNA的转录水平在3 dpi后开始升高,二者在5 dpi时均降低.比较YL040920和CV1988/Rispens对TLRs mRNA转录的影响发现vvMDV YL040920感染小胶质细胞后主要促进其TLR15基因的转录(P≤0.01/0.001),而弱毒疫苗株CV1988/Rispens感染后主要促进TLR1LB基因的转录(P≤0.001).
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4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析
根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析.序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%～99.7%之间.4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化.分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究.
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马立克氏病病毒meq基因细胞转化机制的新研究进展
马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)是禽类马立克氏病(MD)的病原体.MDV有三个血清型,其中MDV-1强毒株不仅可以导致宿主淋巴细胞溶细胞性病变,使淋巴组织萎缩,而且还有转化淋巴细胞能力,诱发淋巴瘤[1].meq是MDV-1的主要致瘤基因,近来研究发现,MEQ不仅具有转录活化作用,它还能与C-末端结合蛋白家族(Ct-BPs)转录辅助抑制因子结合成转录抑制复合物,抑制目的基因转录.
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Ⅰ型马立克氏病病毒不同致病型参考株与中国分离株pp24基因的克隆与序列分析
为了比较Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)的致病型与pp24基因的关系,将Ⅰ型MDV弱毒(mMDV)、强毒(vMDV)、超强毒(vvMDV)、特超强毒(vv+MDV)等不同致病型的CVI988、GA、648A、RB1B、Md5和Md11等6个国际参考株,从中国河北、北京、广东和广西等地分离的7个中国分离株和1个中国疫苗毒814株的pp24基因分别做PCR扩增,并将其克隆到pMD-18载体中测序,与国外已发表的BC-1株进行序列比较.结果表明:Ⅰ型MDV的pp24基因非常保守,15个毒株中只出现5个碱基的随机变化,并引起相应的4个氨基酸改变,但与致病型无明显相关;pp24基因ORF的第81碱基出现差异,所有中国株为G,所有不同致病型国外参考株为C,但并未引起氨基酸改变,显示这一碱基差异只是作为MDV地域性分布的遗传标志,而与病毒分离的年代及致病型等因素无关.
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马立克氏病病毒38kD磷蛋白表达产物的细胞质亲和性
将pcDNA3.1/Zeo表达性载体质粒中的启动子PCMV片段用HindⅢ及BglⅡ消化去除后,在该相应位点插入GA株马立克氏病病毒(MDV)的包含上游调控序列的38kD磷蛋白(pp38)基因的完整片段,以此获得能用自身启动子表达pp38的重组表达性质粒pcDNA-pp38.转染试验表明,pp38基因的天然启动子在整合进载体质粒中后,仍能在鸡胚成纤维细胞(CEF)中启动pp38的表达.用pp38特异性单克隆抗体H19对转染的CEF做间接荧光抗体检测试验发现,在转染细胞中表达的pp38仅位于细胞浆中,基本不进入细胞核.而与此相对照的用pcDNA3.1/Zeo为载体表达的MDV的肿瘤基因meq产物则正相反,仅显现在经转染CEF的细胞核中.meq和pp38基因产物在细胞内的不同分布嗜性显然与它们不同的生物学活性相关.
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串联表达马立克氏病病毒糖蛋白B主要抗原决定簇基因的重组鸡痘病毒的构建
马立克氏病(Marek's disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的一种具有高度传染性、淋巴组织增生性疾病,病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤发生单核细胞浸润为特征[1].MD是世界上重要的家禽传染病之一,是造成世界养禽业重大经济损失的一个主要原因.20世纪70年代早期MD疫苗的发现才使MD得到控制[2].
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液相芯片技术检测马立克氏病病毒方法的建立
目的 建立检测马立克氏病病毒的双抗夹心液相芯片技术方法.方法 将捕获抗体偶联到19号微球,分别确定捕获抗体的偶联量、检测抗体和SA-PE抗体的工作浓度,用建立的液相芯片方法进行特异性、灵敏度、重复性及临床样品的分析.结果 1×106个荧光编码微球的抗体偶联量为2 μg,佳的检测抗体与SA-PE的工作浓度分别为2 μg/mL和4μg/mL.该方法特异性强,只检出马立克氏病病毒,其他病毒未检出;灵敏度为125 pfu/mL;批内批间的变异系数分别为0.85％和2.4％;对58份临床样品检出率为31％.与PCR方法比较,符合率为94.8％.结论 建立的马立克氏病病毒液相芯片检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点.该方法可用于马立克氏病的监测,也可用于SPF鸡的筛选.
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疱疹病毒UL47基因及其编码蛋白研究进展
疱疹病毒是一类双链DNA病毒,包括人巨细胞病毒、牛疱疹病毒Ⅰ型、伪狂犬病毒、单纯疱疹病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病病毒等,可感染人和多种动物.
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MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达
VP22是血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分.本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区.SDS-PAGE电泳发现,VP22 C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右.将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22 C端抗体.通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDV CEF所有细胞核中呈特异性表达.这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用.
关键词： 马立克氏病病毒 CVI988/Rispens株 VP22 大肠杆菌 蛋白转导 -
鸡马立克氏病毒和网状内皮增生病毒感染肉鸡时的相互作用
为了研究鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮增生病病毒(REV)共感染时的相互作用,分别在REV母源抗体阳性(REV-Ab+)和阴性(REV-Ab-)及经MDV疫苗CVI988株免疫和不免疫的商品代肉鸡,比较了二种病毒在病毒血症水平和特异抗体效价上的相互影响.结果表明,在未经CVI988株免疫鸡,REV病毒血症对MDV强毒接种后的病毒血症水平及抗体效价无明显影响,但REV病毒血症显著抑制了CVI988疫苗免疫为鸡提供的抵抗力和抗体效价,因而提高了强毒MDV感染后的病毒血症的程度.另一方面,MDV感染会显著减弱REV-Ab+鸡对REV感染的抵抗力,提高REV-Ab+鸡在感染REV后的病毒血症水平并抑制对它的抗体效价.分析表明,MDV和REV共感染主要通过抑制鸡体的免疫功能来影响另一种病毒的复制及其致病作用.
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Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达
本研究将Ⅰ型超强毒MDV Md11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达.然后将MDV Md11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行Western-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达.
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不同致病型马立克氏病病毒1.8kb基因家族序列比较
为了分析鸡马立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV)的致病性与其1.8kb基因家族的关系,本研究比较了四个不同致病型12个毒株的该基因家族的同源性关系,即弱毒疫苗株、强毒株、超强毒株、特超强毒株和中国野毒株.结果表明:不同毒株间1.8kb基因家族的上游调控序列的同源性在1.8kb基因家族转录方向上大于92.5%,序列间有缺失突变,其中大多数突变发生在弱毒株上.CVI988在TATA box 和上游SP1位点间丢失小片段"5′CTCGG 3′".1.8kb基因家族中存在132bp串连重复序列,CVI988包含3-7个132bp串连重复序列拷贝,强毒株、超强毒株、特超强毒株通常只包含2个串连重复序列.但是已知的中国疫苗毒株814株也只有2个重复序列,表明重复序列的拷贝数不是引起病毒毒力变化的主要原因.各毒株的1.8kb基因家族同源性在97%以上.其中未剪切的1.69kb cDNA中有两个阅读框,分别编码63和64个氨基酸组成的多肽.不同毒株的这二个多肽都很保守,虽然也有一些氨基酸变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系.
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马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达
通过PCR方法扩增MDV Md11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达.诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达.将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清.所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性.
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表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性
提取马立克氏病毒I型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T-easy载体.将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP.用脂质体将其与CVI988 株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况.表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒.
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含HVT部分gB基因马立克氏病病毒的转移载体的构建及表达
根据已发表马立克氏病病毒(MDV)血清Ⅰ型短独特区(US)基因序列,设计一对引物用PCR方法扩增出CVI988/Rispens株的包括部分sorf2和sorf3基因及全部us1和us10基因,并克隆入SK(+)载体中,筛选出阳性载体pBUS10.用PCR的方法在火鸡疱疹病毒(HVT)gB基因主要抗原决定簇的前端及后端分别加上血凝素基因(HA)及终止子TAA,并克隆到pcDNA3 载体中,构建出在CMV启动子和增强子控制下含HA及gB基因主要决定簇的表达盒;将此表达盒克隆入pBUS10载体的us10基因中,构建出一种含HA及gB基因主要决定簇的转移载体pBUS10gB3.转染CHO细胞后,用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验,证实该转移质粒载体可有效地表达HVT gB基因.
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接种不同毒力的马立克氏病病毒后鸡病毒血症的动态比较
1日龄非免疫鸡分别接种马立克氏病病毒（MDV）I型强毒GA株、I 型MDV疫苗毒CVI988株和III型火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗株后第4日起，定期采血并用抗MDV 囊膜糖蛋白B（gB）单克隆抗体介导的间接免疫荧光试验检测MDV在外周血液单核细胞（PBMC S）中的感染状况。结果发现，自接种I型强毒GA株后第4日到鸡发病死亡前，都能检出GA 株引起的病毒血症，并于2周左右达到高峰；自接种CVI988株后第4日到第20日止，能检出病 毒血症，并于第8天左右达到高峰；自接种HVT后第4日到第16日止，能检出病毒血症，并于 第6天左右达到高峰。与此同时，将GA株病毒血症的IFA检测结果与细胞培养上病毒空斑计数 试验结果比较，发现IFA试验比空斑计数试验更为敏感。本试验既可用于判断对鸡作MDV疫苗 免疫的接种效果，又可用于检测MDV野毒感染状态。
