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结核杆菌HSP65与IL-12多价DNA疫苗的构建
[目的]构建结核杆菌H37RV株HSP65基因与IL-12基因的共表达载体pVIV02-HSP65-IL-12,并研究其在Vero-E6细胞内表达的可行性,为新一代结核多价DNA疫苗寻找理论依据.[方法]采用PCR技术,从培养的结核杆菌H37RV中抽提HSP65基因,克隆到pVIV02-MCS上的一个多克隆位点,构建pVW02-HSP65,将质粒pORF-IL-12上的IL-12基因经双酶切后,亚克隆到pVIV02-HSP65上,构建成共表达载体pVIV02-HSP65-IL-12.并经XbaI/AvrⅡ和NeeI/NheI进行双酶切和测序鉴定;用间接免疫荧光法(IFA)检测HSP65和mIL-12基因在Vem-E6细胞中的表达.[结果]双酶切和测序分析证明HSP65基因和mIL-12基因成功克隆到pVIV02-MCS上,且方向正确,序列无突变;间接免疫荧光试验结果为阳性.[结论]共表达载体pVIV02-HSP65-IL-12构建成功,且pVIV02-HSP65-IL-12可在Veto-E6细胞中获得共表达.
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共表达甲型流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒的构建
为构建同时表达流感病毒M1和HA抗原的重组杆状病毒,采用PCR扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1基因和去除信号肽的HA基因,将两基因克隆到杆状病毒转座载体pFastBac Dual的两个启动子下游的多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体pFastBac Dual-M1-HA.将其转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过抗生素、蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-M1-HA,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1-HA.提取重组病毒基因组,通过PCR鉴定外源基因插入成功.间接免疫荧光和Western-blot检测表明,该重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中成功地表达了M1和HA.应用杆状病毒/昆虫细胞系统成功共表达流感病毒M1和HA抗原,为研究流感病毒VLP的形成机制和开发新型流感疫苗奠定了基础.
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双基因共表达在血管再狭窄研究中的应用
目的观察携带反义凝血酶受体(ATR)和p21的双基因载体共表达后对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用,为再狭窄基因治疗寻求新途径. 方法以携带ATR或/和p21的单、双基因载体重组腺病毒伴随病毒(rAAV)感染培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC),用半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达,MTT法测定病毒感染后不同时间点的细胞存活率.将携带AP双基因的rAAV导入WKY大鼠拉伤侧的颈总动脉,免疫组织化学法分别检测凝血酶受体(TR)和p21两基因在动脉壁中的表达. 结果 RT-PCR结果显示,TR单基因的mRNA表达降低,p21单基因表达升高,AP双基因得到了共表达;MTT法测定的生长曲线显示,双基因对hASMC增殖的抑制作用大于两个单基因;免疫组织化学证实,AP双基因导入后,TR基因的表达受到完全抑制,p21基因的表达明显增加,血管新生内膜与平滑肌细胞的增殖受到了抑制. 结论 ATR和p21双基因共表达在体外可明显抑制ASMC的增殖,在体内可明显抑制血管内膜新生和中膜的增生.
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HPV-16-11 L1双价重组杆状病毒的构建及VLP形成
目的 将本地区流行株HPV-16 L1基因与HPV-11 L1基因双表达于杆状病毒昆虫细胞表达系统,组装成类病毒颗粒(viruslike particles,VLP).为研制同时预防宫颈癌和尖锐湿疣等多种疾病的HPV-16-11型基因工程疫苗奠定基础.方法 对本地流行株HPV-16 L1基因进行亚克隆,构建pBluescript-HPV-16L1克隆质粒,并对其测序.再将质粒中HPV-16 L1基因切下,连接到pFastBacDual的强启动子phol后;从克隆质粒Psp73-HPV-11 L1切下HPV-11 L1,连接到pFastBacDual的弱启动子p10后,利用Bac to Bac系统在昆虫细胞Sf9中表达外源蛋白.SDS-PAGE和Western blot鉴定HPV-16 L1和HPV-11 L1蛋白的表达量及特异性,电镜观察昆虫细胞内VLP的存在.结果 酶切和PCR法证实pFastBacDual-HPV-16 L1-HPV-11 L1转移质粒连接正确,转染昆虫细胞Sf9后,检测到HPV-16和HPV-11L1特异蛋白,两种蛋白的相对分子质量(Mr)相近,约56×103;电镜观察到了VLP.结论 本研究利用Bac to Bac系统构建Bacmid/HPV-16-HPV-11 L1,转染到Sf9昆虫细胞后重组外源蛋白得到高效表达,并经电镜证实昆虫细胞内存在较大量VLP,用此VLP免疫BALB/c小鼠后产生抗L1蛋白的抗体.共表达HPV L1蛋白可能为预防多型别HPV感染提供新途径.
关键词： 人乳头状瘤病毒16型 人乳头状瘤病毒L1型 L1基因 共表达 类病毒颗粒 杆状病毒 -
共表达胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶双自杀基因杀伤大鼠血管平滑肌细胞的机制研究
目的:研究共表达胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)双自杀基因对大鼠血管平滑肌细胞的杀伤机制.方法:将表达CD和(或)TK的单、双自杀基因重组腺病毒载体分为4组即Ad-EF1α-CD组、Ad-CMV-TK组、Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-lacZ组.感染原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞,感染复数为20.给予相应的前体药物5-氟胞嘧啶和脱氧鸟苷后,用四甲基偶氮挫盐微量酶反应比色法(MTI)和流式细胞术分析细胞死亡率.荧光染料Hoechst 33342核染色观察凋亡细胞.琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)的降解.结果:血管平滑肌细胞可被重组腺病毒有效感染(70%).MTF检测发现Ad-EF1α-CD-CMV-TK组双自杀基因及其前体药物[5-氟胞嘧啶(30μg/ml)和脱氧鸟苷(0.3μg/ml)]的细胞毒效应可达91%,高于Ad-CMV-TK组(68%)和Ad-EF1α-CD组(63%)单自杀基因组.流式细胞仪分析Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的杀伤作用是以细胞毒性坏死和凋亡为主.凋亡细胞荧光染色显示Ad-EF1o-CD-CMV-TK组和Ad-CMV-TK组细胞的凋亡率分别为11.0%和12.0%,高于Ad-CMV-LacZ组(1.2%)和Ad-EF1α-CD组(5.0%).琼脂糖凝胶电泳发现在Ad-CMV-TK组和Ad-EF1α-CD-CMV-TK组的基因组DNA可见到梯样条带.结论:CD/TK双自杀基因对血管平滑肌细胞的杀伤作用大于CD或TK单自杀基因;其杀伤机制是以诱导细胞的坏死和凋亡为主.
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东部马脑炎病毒E2基因与GM-CSF共表达质粒的构建及其免疫原性初步研究
目的:利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为基因佐剂,提高东部马脑炎病毒E2基因重组质粒的免疫效果.方法:分别扩增E2基因与GM-CSF基因,连接进入含有内部核糖体插入位点(IRES)的真核表达载体中,构建共表达质粒.Lipofectamine2000介导转染真核细胞BHK-21,反转录PCR检测E2和GM-CSF两个基因的转录,Western印迹法和间接免疫荧光法(IFA)检测细胞内E2基因表达产物的抗原性.通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,IFA法测定血清抗体效价,FACS测定免疫小鼠脾细胞中CD4+/CD8+淋巴细胞构成比,初步观察共表达质粒的免疫原性.结果:经酶切鉴定与序列测定证明重组共表达质粒中含有E2和GM-CSF两个基因且序列正确.转染细胞的反转录PCR可见E2和GM-CSF两个基因的转录.Western印迹结果可见转染细胞的裂解液在相对分子质量50 000位置有特异性条带.将转染细胞制成荧光抗原片,经IFA检测可见胞浆中出现特异荧光.免疫小鼠的高血清抗体效价为1:160,但细胞免疫未观察到明显的提高.结论:构建的共表达质粒pE2-IRES-mGM-CSF具有良好的免疫原性,能有效刺激小鼠特异性体液免疫应答,提高了E2基因重组质粒诱导的血清抗体效价.
关键词： 东部马脑炎病毒 E2基因 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 共表达 免疫原性 -
稳定表达hMATE1及共表达hMATE1与hOCT1或hOCT2细胞模型的构建
为构建稳定表达人多药及毒素外排转运体1 (hMATE1)的转基因细胞模型,提取人肾总mRNA,经逆转录PCR获得hMATE1 cDNA,借助HindⅢ、Kpn Ⅰ两个酶切位点与pcDNA3.1(+)重组获得重组质粒.将pcDNA3.1(+)-hMA TE1重组质粒转染至MDCK、MDCK-hOCT1和MDCK-hOCT2细胞中,经潮霉素B抗性筛选后,以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)的积聚实验筛选获得具有良好hMATE1功能的单克隆.测定筛选获得的细胞中转运体mRNA的表达量,并表征其对二甲双胍的积聚或对西咪替丁的转运能力.结果表明,本研究构建的MDCK-hMATE1、MDCK-hOCT 1/hMATE1、MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型均高表达hMATE1 mRNA,MDCK-hMATE1细胞对二甲双胍的积聚为转染空载体细胞的17.6倍;MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞对西咪替丁的净外排率分别为17.5和3.65.因此,本研究成功构建了稳定表达hMATE1及共表达hMATE1与hOCT1或hOCT2的细胞模型,可用于hMATE1及其与hOCT1或hOCT2共同参与的药物转运或药物-药物相互作用的体外研究.
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共表达PXRLBD和SRC88以及PXR配体筛选的平衡透析模型的建立
孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR),属核受体NR1I亚家族.PXR可由配体活化,当配体(如外源药物)与其配体结合域(ligand binding domain,LBD)结合后,PXR被活化,招募辅调控因子(如人甾体受体辅活化因子-1,steroid receptor eoactivator-1,SRC-1)形成复合物,通过其DNA结合域(DNA binding domain)结合到药物代谢酶基因启动子的特定DNA序列上,从而调控CYP3A4等药物代谢酶基因的转录[1,2].
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甘草鲨烯合酶1基因多态性及其与β-香树脂醇合成酶共表达对β-香树脂醇积累的影响研究
甘草是我国常用的大宗药材之一.甘草中主要的活性成分为甘草酸,其生物合成途径受到很多酶的调节.鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)及β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)是其中的两种关键酶.为了揭示鲨烯合酶基因多态性及其与β-香树脂醇合成酶共表达对MVA代谢途径的影响,本文构建了7种载体,分别含有3种不同的SQS1基因和β-AS基因,将其在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达,通过TLC及GC-MS检测代谢产物β-香树脂醇的含量.结果显示SQS1基因与β-AS基因共表达有助于代谢产物β-香树脂醇的积累,在3种不同的SQSl基因中,以SQS12为好.本文为进一步研究功能基因对甘草酸代谢途径的影响以及提高甘草酸的含量奠定了理论基础.
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反义TR和p21双基因共表达对人主动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的作用
目的观察携带反义凝血酶受体(ATR)或/和p21的单、双基因重组腺病毒伴随病毒(rAAV)载体对人主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖与凋亡的影响.方法以携带ATR或/和p21的单、双基因rAAV感染人ASMC.半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达;MTT法测定感染不同时间点的细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期与凋亡细胞数目的变化;吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色检测凋亡细胞的比率.结果单、双基因在ASMC中均获得整合,且双基因发生了共表达;病毒感染4 d时,ATR组、p21组和AP双基因组的细胞存活率与对照组相比分别降低了16.7%、21.6%和29.4%;三组的G0/G1期细胞数分别为(61.8±2.9)%、(82.5±4.0)%和(80.4±6.1)%;凋亡细胞数为(4.8±0.5)%、(5.7±0.1)%和(9.2±0.9)%;AO/EB染色显示的凋亡细胞比率分别为:对照组(1.5±0.8)%、ATR组(7.2±3.3)%、p21组(10.7±5.6)%、AP组(18.3±2.7)%.结论(1)双基因共表达对抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用均较单基因具有较强的生物学效应.(2)为再狭窄的基因治疗提示了更优化的途径.
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血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定
背景:人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道.目的:构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒.方法:将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn Ⅰ/Xba Ⅰ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV- VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定.将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析.结果与结论:酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体.
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PFP、GrB真核共表达载体的构建及表达分析
目的:体外扩增出PFP、GrB基因的全片段并构建共表达重组体pVAX1-PIG(即 pVAX1-PFP-IRES-GrB),分析其在人喉癌细胞Hep-2中的表达情况.方法:利用RT-PCR的方法从人的喉癌组织浸润淋巴细胞中扩增全长PFP、GrB的cDNA片段并构建共表达重组体pVAX1-PIG.利用脂质体LipofectamineTM2000将重组真核表达载体pVAX1-PIG转染入人的Hep-2细胞株中,采用RT-PCR、间接免疫荧光法分析其在人Hep-2中的表达情况.结果:经双酶切、测序法证实已成功扩增PFP、GrB基因的全长cDNA,并构建共表达重组体pVAX1-PIG,在荧光显微镜下可见已转染pVAX1-PIG的人Hep-2细胞的胞浆发出苹果绿色荧光.结论:成功扩增PFP、GrB全片段、构建共表达重组体pVAX1-PIG,并在人Hep-2细胞中检测到PFP、GrB蛋白的表达,穿孔素(PFP)/颗粒酶B共同表达能够介导细胞的凋亡,为其在喉癌治疗中的应用研究奠定了基础.
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抗VEGF单克隆抗体Fab片段在大肠杆菌的表达
目的:构建、表达、纯化抗血管内皮生长因子(VEGF)的Fab片段(眼明,Vasculizumab),并检测其抗VEGF的活性.方法:首先对轻链(LC)及重链(HC)基因进行密码子优化并做了全基因合成,将补充了OmpA信号肽核苷酸序列的轻链及重链基因分别克隆到表达质粒pET21a中,成功构建共表达质粒pET21 a-LC-HC,目的基因测序正确.然后转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)中诱导表达,并进行了温度和IPTG诱导浓度的条件优化.结果:确定大肠杆菌周质分泌表达摇瓶发酵佳条件为:OD600达到0.6 ～0.8时加入0.1 mmol/L IPTG,18℃诱导18小时.SDS-PAGE检测目的蛋白Fab有表达.结论:表达纯化后的Fab有抗VEGF活性,可为新药筛选提供材料.
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急性早幼粒细胞白血病中CD117和CD34共表达的临床意义
目的:研究CD117和CD34在成人急性非淋巴细胞白血病(Acute nonlymphoblastic leukemia,ANLL)M1～M2型和急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)M3患者中的表达,重点探讨M3患者CD117和CD34共表达(CD117/CD34共表达)的临床意义.方法:将研究病例分为M1～M2和M3二组,采用流式细胞术(Flow cytometery,FCM)随机检测54例M3和63例M1～M2二组初诊患者骨髓单个核细胞(BMMNC)髓系抗原CD117和干(祖)细胞抗原CD34的表达;比较M1～M2和M3二组ANLL患者中CD117、CD34表达的阳性率的差异,以及CD13、CD33和CD117分别与CD34共表达的阳性率差异.结果:CD117在M1～M2组患者中表达的阳性率是71.4/%(45/63),在M3组表达的阳性率为66.7%(36/54),差异无统计学意义(P=0.58);CD34在M1～M2和M3二组中表达的阳性率分别为66.7%(42/63)和11.1%(6/54),差异有统计学意义(P=0.000);二组ANLL的CD117/CD34共表达阳性率分别为71.1%(45/63)和7.4%(4/54),其差异有统计学意义(P=0.000).结论:CD117可作为AL的髓系免疫学标志,但其在ANLL中的表达缺乏系列内阶段特异性.M3患者的CD34表达和CD117/CD34共表达的阳性率低于M1～M2者;CD117/CD34共表达可作为M1～M2和M3鉴别诊断的免疫学分型参考指标.
关键词： 急性早幼粒细胞白血病 抗原CD117 抗原CD34 共表达 急性非淋巴细胞白血病 -
Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达
目的 构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达.方法 采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达.结果 酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确.转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内.结论 已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Iprl抗结核的功能奠定了基础.
关键词： 胞内病原体抗性基因1 绿色荧光蛋白 穿梭质粒 共表达 肺癌细胞 -
新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响
目的 分析新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响.方法 在6孔细胞培养板上将4种重组表达质粒以pCI-M+pCI-NP+pCI-F和pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48 h,光镜观察细胞融合现象.在25 cm2细胞培养瓶中,将4种重组表达质粒以上述两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48 h,收集细胞上清,离心后,电镜观察有无病毒样颗粒.结果 以pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN组合共转染BHK-21细胞,可以观察到明显的细胞融合现象,而以pCI-M+pCI-NP+pCI-F组合共转染的BHK-21细胞则未出现细胞融合现象.两种组合共转染均形成了新城疫病毒样颗粒,包含HN蛋白基因的4种重组质粒组合共转染形成的病毒样粒子更接近于真实的新城疫病毒粒子.结论 HN蛋白基因具有促进细胞融合的功能,新城疫病毒样颗粒的成功表达为新城疫病毒致病机理和新型疫苗的研究奠定了基础.
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基于口蹄疫病毒2A片段的多基因共表达质粒的构建及表达
目的 构建基于口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV) 2A片段的多基因共表达质粒,并在293T细胞中共表达HBx、人Sox2及人c-Myc基因.方法 以FMDV 2A自剪切片段连接HBx、Sox2和c-Myc基因编码序列,克隆至载体pEGFP-C1,构建多基因共表达质粒pEGFP-XSM;在脂质体LipofectamineTM 2000的介导下,将重组质粒pEGFP-XSM转染293T细胞,同时设空载体组(转染空载体pEGFP-C1)和空白对照组(未转染),转染48 h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达;Real-time PCR和Western blot法分别检测各组293T细胞中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平.结果 多基因共表达质粒pEGFP-XSM经酶切和测序鉴定构建正确;空载体组和pEGFP-XSM转染组细胞荧光镜下均可见GFP的表达;pEGFP-XSM转染组中HBx、Sox2和c-Myc基因mRNA的转录水平较空白对照组及空载体组均明显升高(P＜0.001);pEGFP-XSM转染组可见相对分子质量约48 000的GFP-HBx-2A融合蛋白条带和约38 000的HA-Sox2-2A融合蛋白条带,各组均可见相对分子质量约49 000的c-Myc蛋白条带,pEGFP-XSM转染组c-Myc蛋白的表达水平明显高于空白对照组及空载体组(P＜0.01).结论 成功构建了多基因共表达质粒pEGFP-XSM,并在293T细胞中实现了HBx、Sox2和c-Myc蛋白的共表达,为进一步深入研究该共表达蛋白在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展中的生物学机制奠定了基础.
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激活素受体相互作用蛋白1,2在小鼠脑神经细胞中的共表达
目的 探讨激活素受体相互作用蛋白1(activin receptor-interaction protein 1,ARIP1)和ARIP2在小鼠脑神经细胞中的共表达.方法 RT-PCR法检测C57BL小鼠小脑、垂体、大脑、脾脏、心脏、肾脏、肝脏、胰腺组织中ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录；以融合蛋白GST-ARIP1C和MBP-ARIP2C作为抗原免疫新西兰白兔,制备抗ARIP1和ARIP2抗体,经A蛋白亲和层析柱纯化后,ELISA法检测抗体的交叉反应；用制备的抗体,采用免疫组织化学染色检测ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织中的表达；RT-PCR法检测小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞中激活素ⅡA型受体(activin receptorⅡA,ActRⅡA)、ARIP1和ARIP2基因mRNA的转录.结果 在小鼠大脑、小脑及垂体组织中可见ARIP1基因mRNA的转录,在小鼠各部位组织中均可见ARIP2基因mRNA的转录；制备的兔抗ARIP1和ARIP2抗体无交叉反应；ARIP1和ARIP2在小鼠脑组织的海马和下丘脑同时表达；ActRIⅡA及ARIP1和ARIP2 mRNA在神经元样细胞系Neuro-2a细胞中共表达.结论 ARIP1和ARIP2可在小鼠脑神经细胞中共表达.
关键词： 激活素受体相互作用蛋白 神经元 共表达 -
活血化瘀方抗糖尿病心肌病的药理调控机制研究
目的:从基因表达谱的角度探究活血化瘀方抗糖尿病心肌病的药理调控机制.方法:采用链脲霉素建立糖尿病心肌病大鼠模型后,随机分组并对其中一组给予活血化瘀方灌胃,检测生理数据,并取样进行基因表达水平检测.针对芯片数据,初处理后依次进行:基因表达差异分析、基因表达与性状相关性分析、基因连接性差异分析和加权的基因共表达网络分析,后整合上述多种分析结果,寻找关键基因.结果:成功建立糖尿病心肌病大鼠模型,并得到一系列从不同角度分析的结果:一千多个差异表达基因,五千多个差异连接性基因,鉴定出三个共表达网络中的关键模块以及三个关键基因.结论:活血化瘀方通过调节与糖尿病心肌病或者糖尿病密切相关的生物分子及其活动,同时综合作用于多种基础的细胞生理活动,从而影响糖尿病心肌病的发展.
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人促红细胞生成素基因和GFP共表达的输卵管特异性表达载体的构建
本实验从蛋鸡输卵管基因组DNA中扩增出约1.3kb的卵清蛋白5′端调控区(OV),并从质粒扩增出人促红细胞生成素(hEPO)基因组DNA.将hEPO亚克隆入pEGFP-C1载体的多克隆位点,命名为pEGFP-hEPO,然后将OV片段亚克隆入经AseⅠ和Vsp Ⅰ双酶切的切口处,替换掉CMV启动子,经测序和酶切鉴定正确,成功构建了鸡卵清蛋白5′端调控区调控人促红细胞生成素的共表达载体pOV-GFP-hEPO.并利用脂质体转染法转染鸡输卵管上皮细胞,用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达,结果显示共表达载体pOV-GFP-hEPO能够在鸡输卵管上皮细胞定位表达.为制备生产人促红细胞生成素的鸡输卵管生物反应器奠定了基础.
