首页 > 文献资料
-
桑黄鲨烯合酶基因片段的克隆与序列分析
目的:对桑黄鲨烯合酶(SS或SQS)基因进行克隆及序列分析.方法:搜索网上美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中SS基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与SS相似性高的片段,并根据它设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增SS基因片段并对PCR产物进行测序.结果:得到一段492bp的序列,序列分析表明,该片段编码164个氨基酸,与其他物种SS基因核苷酸序列同源性高在84％以上.结论:首次从桑黄中克隆出了SS基因,为有效利用该基因奠定了基础.
-
建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究
泽泻鲨烯合酶(AoSS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶.为深入研究AoSS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体pCzn1上,并在大肠杆菌BL21 (Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻AoSS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中AoSS表达高,其次为叶,根中表达甚微.原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展AoSS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据.
-
雷公藤鲨烯合酶基因全长cDNA克隆及诱导表达分析
根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计引物,克隆得到雷公藤鲨烯合酶基因TwSQS全长cDNA (GenBank:KR401220),并对其进行生物信息学分析和诱导表达分析.TwSQS cDNA全长为1 800 bp,开放阅读框为1 242 bp,编码413个氨基酸,编码的蛋白理论等电点为7.94,相对分子质量为47.20 kD.雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MJ)诱导后,荧光定量PCR表明TwSQS相对表达量明显上升,并于诱导后4h达到高.本研究首次克隆得到雷公藤SQS基因,为进一步解析雷公藤三萜类成分生物合成途径奠定基础.
-
甘草鲨烯合酶1基因多态性及其与β-香树脂醇合成酶共表达对β-香树脂醇积累的影响研究
甘草是我国常用的大宗药材之一.甘草中主要的活性成分为甘草酸,其生物合成途径受到很多酶的调节.鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)及β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)是其中的两种关键酶.为了揭示鲨烯合酶基因多态性及其与β-香树脂醇合成酶共表达对MVA代谢途径的影响,本文构建了7种载体,分别含有3种不同的SQS1基因和β-AS基因,将其在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达,通过TLC及GC-MS检测代谢产物β-香树脂醇的含量.结果显示SQS1基因与β-AS基因共表达有助于代谢产物β-香树脂醇的积累,在3种不同的SQSl基因中,以SQS12为好.本文为进一步研究功能基因对甘草酸代谢途径的影响以及提高甘草酸的含量奠定了理论基础.
-
蛇足石杉鲨烯合酶HsSQS1基因克隆和序列分析
鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)是植物萜类化合物生物合成途径的关键酶.本研究根据课题组已获得的蛇足石杉(Huperzia serrata)转录组数据中的SQS1转录本序列,设计基因全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得蛇足石杉SQS1基因的全长cDNA序列；利用实时荧光定量PCR方法检测了HsSQS1基因在蛇足石杉根、茎、叶中的表达情况；对HsSQS1基因进行生物信息学分析,并预测HsSQS1编码蛋白的结构与功能.研究结果表明,克隆获得的蛇足石杉SQS1基因长为1263 bp,编码420个氨基酸,命名为HsSQS1,GenBank登录号JQ004938.HsSQS1基因在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶.本研究成功克隆并分析了蛇足石杉SQS1的全长序列,为进一步阐明蛇足石杉三萜代谢途径奠定基础.
-
红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析
目的 克隆红花栝楼鲨烯合酶(squalene synthase,SS)的基因并进行序列分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础.方法 根据绞股蓝与罗汉果SS基因cDNA比对分析的结果,设计SS的5'端简并引物,采用3'RACE扩增红花栝楼SS全长cDNA基因.结果 获得红花栝楼SS cDNA全长共1 466个核苷酸,其中包括一个含有1 254个核苷酸的开放读码框,编码417个氨基酸残基.通过NCBI的Blast比对,发现红花栝楼SS基因编码的氨基酸序列与已知植物SS基因编码的氨基酸序列同源性为78％～94％,核苷酸的同源性为74％～93％.结论 成功克隆了红花栝楼SS的全长cDNA,为进一步研究红花栝楼SS基因结构、基因表达、基因突变提供了基础,并为葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持.
-
建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析
目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶(squalene synthase,SS)进行基因全长的克隆和生物信息学分析.方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究.结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1577bp,包含一个长1230bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性.预测该蛋白的相对分子质量为4.68×104,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸(DXXDD)的保守功能域.结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据.
-
天山雪莲鲨烯合酶SiSQS1和SiSQS2调控β-谷甾醇合成机制研究
目的 通过比较天山雪莲Saussureainvolucrata细胞中鲨烯合酶SiSQSl和SiSQS2的位点变异、蛋白原核表达及表达水平差异以及下游产物β-谷甾醇量的高低,探索天山雪莲细胞SiSQS1和SiSQS2催化p-谷甾醇合成的机制.方法 从天山雪莲细胞中克隆出β-谷甾醇生物合成途径上关键酶SiSQS1与SiSQS2基因,并对其进行生物信息学分析;分别对sisQs1和SiSQS2进行原核表达与条件优化,比较二者在天山雪莲细胞中的蛋白原核表达差异;采用RT-PCR技术对二者在天山雪莲三色系细胞中的表达水平进行比较,采用GC-MS对雪莲三色系细胞中β-谷甾醇进行定量分析,并对p-谷甾醇量与SiSQS1、SiSQS2表达水平做相关性分析.结果 SiSQS1和SiSQS2在242E/D存在残基变异,原核表达及条件优化实验表明二者都有目的蛋白条带出现,但二者之间的原核表达适体系不同;化学定量与基因表达水平的相关性分析表明β-谷甾醇量与SiSQS1、SiSQS2基因表达水平呈正相关,相关系数分别为0.92和0.89.结论 SiSQS1与SiSQS2二者242E/D残基变异可能影响SiSQS蛋白的表达,二者在催化活性以及对β-谷甾醇积累调控作用上可能存在一定的功能差异,为研究鲨烯合酶SQS调控天山雪莲细胞β-谷甾醇积累的机制提供了技术支持和奠定了理论基础.
-
青蒿鲨烯合酶基因打靶研究
目的 通过代谢途径工程调整代谢流向,试图增大转基因青蒿Artemisia annua植株中的青蒿素产量.方法 利用青蒿鲨烯合酶(SS)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胞嘧啶脱氨酶(CodA)基因构建基因打靶载体,并通过冻融法将载体导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens.以叶盘法转化青蒿,采用"分段选择法"筛选转基因再生植株.结果 对表达GFP基因后发出绿色荧光的转基因植株,采用PCR及PCR产物杂交法,在1棵转基因植株中检测到外源GFP基因,而未检测到内源SS基因.初步证据显示,在转基因青蒿植株中,突变型SS基因已取代野生型SS基因.结论 青蒿鲨烯合酶基因打靶已取得初步成功.
-
刺五加法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶基因启动子CpG岛的预测与功能验证
目的 获得刺五加法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)基因启动子的CpG岛分布情况和功能活性.方法 针对己克隆的FPS、SS、SE基因启动子序列,使用EMBOSS和Li Lab进行CpG岛预测,同时利用GUS基因作为报告基因,pCAMBIA 1301质粒作为表达载体,利用根癌农杆菌转化拟南芥进行功能验证.结果 发现刺五加FPS、SS启动子含有2个CpG岛,长度分别是520、218bp和108、103 bp,SE启动子含有3个CpG岛,长度为290、119、149 bp.FPS、SS、SE基因启动子均具有启动活性,但强度不一,SS启动子活性强.结论 研究首次获得刺五加FPS、SS、SE基因启动子区域的CpG岛分布情况,以及其功能活性,为后续进一步FPS、SS、SE甲基化分析及其在刺五加中的表达调控研究奠定了基础.
