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建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究
泽泻鲨烯合酶(AoSS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶.为深入研究AoSS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体pCzn1上,并在大肠杆菌BL21 (Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻AoSS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中AoSS表达高,其次为叶,根中表达甚微.原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展AoSS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据.
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建泽泻法呢基焦磷酸合酶分子克隆、分布表达及生物信息学研究
三萜类化合物是道地药材建泽泻中的主要药效成分,在癌症治疗方面有很大的应用潜力.法呢基焦磷酸合酶(FPPS)为三萜类化合物合成途径中的重要限速酶之一,本文运用同源克隆和快速cDNA末端扩增(PACE)技术相结合的方法,克隆了建泽泻FPPS基因的全长cDNA(accessionn no.HQ724508),FPPS cDNA全长为1 531 bp,含有1个1 032 bp的开放阅读框,编码343个氨基酸的蛋白,包含5个保守的功能域,其中两个富含天冬氨酸(DDXXD).实时荧光定量PCR(QRT-PCR)结果显示建泽泻FPPS基因在各器官中均有表达,10月至12月上旬相对表达量呈上升趋势,后下降,其中叶片表达量较高,块茎、根、叶柄表达量相对较低.高效液相(HPLC)分析结果表明不同生长期建泽泻主要药效成分23-乙酰泽泻醇B变化趋势与FPPS基因表达量变化一致,初步证明FPPS是泽泻醇类化合物合成途径中的重要调控位点.本研究为利用植物基因工程改善中药材品质提供科学依据.
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建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析
目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶(squalene synthase,SS)进行基因全长的克隆和生物信息学分析.方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究.结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1577bp,包含一个长1230bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性.预测该蛋白的相对分子质量为4.68×104,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸(DXXDD)的保守功能域.结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据.
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泽泻临床应用及免疫调节作用的研究进展
泽泻Alismaorientalis(Sam.)Juzep.系泽泻科植物的干燥块茎,在我国有悠久的药用历史.主产于福建、四川等省,故有"建泽泻"、"川泽泻"之称.现将泽泻临床应用及免疫调节作用研究进展综述如下.
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基于 ITS2序列的建泽泻及其混伪品鉴定研究
目的：利用 ITS2条形码鉴别建泽泻及其混伪品。方法提取28份建泽泻及其混伪品基因组 DNA，PCR 扩增 ITS2序列并进行双向测序，测序结果提交至 GenBank，同时从 GenBank 下载泽泻科植物及其混伪品10种17条 ITS2序列，对提交与下载的45条序列，应用 MEGA 5．1软件进行序列比对，计算种内和种间距离，采用相似性搜索法、近距离法进行鉴定分析，并构建 NJ 系统进化树直观反映鉴定结果。结果建泽泻、川泽泻 ITS2序列长度均为311 bp，存在1个变异位点；建泽泻与泽泻科泽泻属物种距离较近，与泽泻科其他属及其混伪品之间遗传距离较远；NJ 树结果显示建泽泻及其混伪品均可明显区分，表现出良好的单系性。结论 ITS2序列作为 DNA 条形码可以准确快捷地鉴别建泽泻及其混伪品，为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了新的技术手段。
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建泽泻光合特性及其与环境因子的相互关系研究
目的 研究建泽泻叶片光合特性及其与环境因子的相互关系.方法 利用LI-6400型便携式光合测定仪,测定建泽泻叶片的净光合速率日变化、环境因子日变化以及光响应.结果 建泽泻叶片净光合速率(Pn)与气孔导度(Gs)光合日变化呈双峰曲线,蒸腾速率(Tr),胞间CO2浓度(Ci)及气孔限制值(Ls)日变化呈单峰曲线,水分利用率(WUE)呈单谷型曲线.相关性分析表明,建泽泻叶片Pn与主要影响因子光合有效辐射(PAR),Gs,Tr,大气温度(Ta)和WUE呈正相关,与空气相对湿度(RH),Ci和Ls呈负相关.结论 建泽泻为气孔限制型阳生植物,Pn存在明显的“光合午休”现象,气孔导度、水分利用率、光合有效辐射和蒸腾速率是影响建泽泻叶片净光合速率的主要环境因子,本研究为提高药材质量和产量及指导建泽泻合理栽培提供了科学依据.
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建泽泻与川泽泻饮片的对比研究
目的：对建泽泻与川泽泻进行对比研究。方法传统方法测量泽泻饮片的直径、败片率、碎屑率；采用现代方法测定其水分、总灰分、浸出物；采用HPLC法检测23－乙酰泽泻醇B含量及特征指纹峰。结果通过外观性状及内在质量可以看出建泽泻与川泽泻区别明显。结论建议建泽泻与川泽泻应分别收录。
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建泽泻HMGR基因保守区片段克隆与组织分布研究
目的:对建泽泻三萜类成分生物合成关键酶HMGR基因保守区片段进行克隆与组织分布研究.方法:以建泽泻总RNA为模板,通过RT-PCR方法,克隆HMGR基因的保守区片段,并用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测HMGR基因在不同器官中的表达情况.结果:所克隆的建泽泻HMGR基因保守区序列长度为458 bp(GenBank注册号为HQ913638),与药用植物黄花蒿、柴胡、杜仲、丹参的同源性分别达到86.8%、88.2%、88.2%、85.5%,QRT-PCR结果显示HMGR基因在建泽泻各器官中均有表达,其中叶片表达量较高,块茎、根、叶柄表达量相对较低.结论:首次分离并报道了建泽泻HMGR基因保守区片段克隆及其组织分布,为泽泻三萜类成分生物合成途径的阐明和生物工程应用提供科学依据.
关键词： 建泽泻 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 基因克隆 实时荧光定量PCR -
建泽泻的道地性研究
建泽泻是福建的道地药材,具有悠久的生产历史.本文从建泽泻的本草史籍及地方志记载传统的种植和加工技术,质量标准和规格等级化学成分,以及产销情况等五个方面论述建泽泻的道地性及质量优良.
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建泽泻盐炙工艺优化及其HPLC指纹图谱的建立
目的:优化建泽泻盐炙工艺并建立其高效液相色谱(HPLC)指纹图谱.方法:以23-乙酰泽泻醇B、总三萜含量和外观性状综合评分为指标,采用单因素试验和正交试验,优化建泽泻盐炙工艺中用盐量、炒制温度和炒制时间3个因素的水平.采用HPLC法分别在208、245 nm波长下建立10批建泽泻盐炙品的指纹图谱,经软件比较其与对照图谱的相似度.结果:优工艺为每100 kg泽泻加10 kg水溶解的2 kg盐,闷润1 h,在100℃下炒制8 min.验证试验中,3批盐炙品外观性状均符合要求,综合评分平均值为93.94(RSD=6.63%,n=3);23-乙酰泽泻醇B和总三萜含量稳定,RSD分别为7.41%、7.39%(n=3).在208、245 nm波长下分别标定了建泽泻盐炙品的17、10个共有峰;10批样品指纹图谱相似度均大于0.9.结论:优化的建泽泻盐炙工艺合理可行、重现性好;建立的指纹图谱共有峰稳定,可用于建泽泻盐炙品的质量评价.
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焦磷酸测序鉴定建泽泻方法的建立
目的: 建立一种基于内部转录间隔区2 ( ITS 2) 序列突变位点鉴别建泽泻的焦磷酸测序方法.方法: 分别提取建泽泻与川泽泻的须根、叶片、叶柄DNA, 采用焦磷酸测序方法进行分析鉴定, 并通过毛细管电泳测序验证方法的正确性.结果: 建立了一种基于ITS 2序列焦磷酸测序鉴定方法, 经毛细管电泳测序验证结果准确可靠.建泽泻ITS 2序列中的突变位点A-T的突变频率均不小于83% .结论: 焦磷酸测序方法可以准确鉴定不同基源的泽泻物种.
