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蛇足石杉HsCAS1基因克隆及序列分析
本研究对蛇足石杉(Huperzia serrata)环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)基因HsCAS1编码区进行克隆及序列分析.根据本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,从中获得1条具有环氧角鲨烯环化酶保守结构域的编码CAS的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的编码区序列,并对HsCAS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析.利用实时荧光定量PCR方法检测HsCAS1基因在蛇足石杉的根、茎、叶中的表达情况.序列分析表明,所克隆的HsCAS1基因编码区长为2,271 bp,编码756个氨基酸残基,HsCAS1与紫果冷杉(Abiesmagnifica)的CAS具有61％的序列相似性.生物信息学预测HsCAS1蛋白含有3个跨膜区,具有萜类环化酶等保守结构域,不合信号肽.HsCAS1在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶.本研究在国内外首次获得蛇足石杉HsCAS1基因的编码区序列,为进一步研究HsCAS1在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础.
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相对湿度对蛇足石杉生理生化指标的影响
目的:研究相对湿度对蛇足石杉生理生化指标的影响.方法:设置不同相对湿度,测定蛇足石杉可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性.结果:90%相对湿度条件比较适合蛇足石杉生长.结论:本试验结果可为蛇足石杉规范化种植(GAP)提供参考.
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土壤微生物影响蛇足石杉扦插生根的机制研究
目的:研究蛇足石杉原土壤微生物对其扦插生根的影响及其机制.方法:蛇足石杉分别扦插于原生境土壤和灭菌土壤上,调查其生根率,测定生根过程中吲哚乙酸(IAA)、酚类化合物(儿茶酚、槲皮素、绿原酸、阿魏酸)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的变化.结果:原生境土壤微生物能够提高蛇足石杉的生根率.增加生根条数,提高生根过程中IAA、儿茶酚、绿原酸、阿魏酸的含量,影响了PPO,POD的活性.结论:原生境土壤上蛇足石杉扦插生根率高的重要原因是土壤微生物提高了蛇足石杉生根过程中I从和儿茶酚、绿原酸、阿魏酸等酚类化合物含量.
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蛇足石杉内生真菌抗乙酰胆碱酯酶活性筛选及分类鉴定
目的:从蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Murray) Trevis.内生真菌中筛选具有抗乙酰胆碱酯酶活性的菌株.方法:利用乙酰胆碱酯酶水解α-萘乙酯的产物和固蓝B盐发生显色反应的原理,用薄层色谱-生物自显影法对59株蛇足石杉内生真菌发酵产物进行抗乙酰胆碱酯酶活性筛选,并通过18s rDNA和5.8s rDNA序列分析结合形态学特征对目标菌株进行分类鉴定.结果:蛇足石杉内生真菌LQ2F01在抗乙酰胆碱脂酶活性筛选中呈现阳性颜色反应,18s rDNA和5.8s rDNA序列分析并结合形态学分类表明该菌株属枝顶孢霉属Acremonium.结论:蛇足石杉内生真菌LQ2F01表现出和宿主植物相同的抗乙酰胆碱脂酶活性,在天然药物开发以及内生真菌与宿主植物关系的研究中具有重要意义.
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微生物对蛇足石杉扦插生根及若干生理生化指标的影响
目的:研究原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对蛇足石杉扦插生根率和若干生理生化指标的影响.方法:蛇足石杉分别在原生境土壤(土壤Ⅰ)、接种了内生真菌和根表真菌的灭菌土壤(土壤Ⅱ)、灭菌土壤(土壤Ⅲ)上进行扦插,调查蛇足石杉扦插生根率,测定可溶性蛋白含量,可溶性糖含量,PPO(多酚氧化酶),POD(过氧化物酶)活性、黄酮类化合物和石杉碱甲含量.结果:与土壤Ⅲ上的扦插蛇足石杉相比,土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上植株生根率,分别提高了10%和16%,土壤Ⅱ上扦插植株茎中的可溶性蛋白含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ上扦插植株叶片和茎中的可溶性糖含量显著提高(P<0.05),土壤Ⅰ和土壤Ⅱ上的扦插植株的黄酮类化合物含量显著提高.结论:原生境土壤微生物、内生真菌和根表真菌对扦插蛇足石杉的生根有促进作用,提高蛇足石杉体内的代谢
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蛇足石杉内生真菌分离及其抑制乙酰胆碱酯酶活性研究
目的:研究药用植物蛇足石杉内生真菌的分布及其多样性,并筛选具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的内生真菌.方法:采用平板分离法分离蛇足石杉内生真菌,结合形态学和ITS-rDNA序列分析鉴定内生真菌;并采用DTNB显色法,对分离获得的内生真菌进行乙酰胆碱酯酶抑制活性的筛选.结果:共分离到127株内生真菌,分属于Penicillium,Aspergillus,Podospora等19个属;根、茎、叶中内生真菌的分布存在一定的组织差异性,茎中内生真菌的分离率和定殖率高,叶中次之,根中少.共有来自巧个属的39株内生真菌显示出乙酰胆碱酯酶抑制活性,且11株有显著的抑制活性,其中7株来源于叶中.结论:药用植物蛇足石杉内生真菌多样性丰富,不同组织部位内生真菌的数量、种类及分布存在一定差异;同时蛇足石杉蕴含着大量抑制乙酰胆碱酷酶活性的内生真菌,为寻找和开发具有乙酰胆碱醋酶抑制活性的药用资源开辟了一条新的途径.
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中药有效成分石杉碱甲的多靶点作用研究进展
石杉碱甲(Huperzine-A,HupA)是从中国民问草药蛇足石杉(Huperzia serrata)(又名千层塔)中分离得到的1种新型石松类生物碱有效单体.近年来大量临床研究发现其对阿尔茨海默病(AD)、血管性痴呆(VD)、智力低下、精神分裂以及其他神经退行性疾病均有一定的治疗作用,且外周不良反应轻微.因此,HupA具有多重神经保护作用.除了乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)之外,它还具有多个分子作用靶点.
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蛇足石杉生物碱成分的研究(Ⅴ)
目的：研究石杉科蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb.)Trev.中的生物碱成分。方法：用各种色谱技术进行分离纯化，根据光谱分析鉴定其结构。结果：从蛇足石杉中分离得一个生物碱成分(碱A)。结论：碱A为新化合物，命名为蛇足石杉碱乙(huperzinine B)。
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蛇足石杉碱丙的结构鉴定
目的研究石杉科植物蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb.) Trev.的生物碱成分.方法采用各种色谱技术进行分离纯化,经光谱数据分析鉴定其结构.结果从蛇足石杉中分离得到一个生物碱单体.结论该化合物为一具三环结构的新的lycodine型生物碱,命名为蛇足石杉碱丙(huperzinine C).
关键词： 蛇足石杉 蛇足石杉碱丙 lycodine型生物碱 -
蛇足石杉中一个新的Phlegmariurine型生物碱
目的研究石杉科植物蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb.) Trev.的生物碱成分.方法应用各种色谱技术进行分离纯化,经衍生物制备和光谱数据分析鉴定其结构.结果从蛇足石杉中分离得到1个新生物碱. 结论该化合物为一新的phlegmariurine型生物碱,命名为8β-羟基马尾杉碱乙(8β-hydroxy phlegmariurine B).
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蛇足石杉新碱的结构鉴定
目的研究石杉科植物蛇足石杉Huperzia serrata (Thunb.) Trev.的生物碱成分.方法用各种色谱技术进行分离纯化,经衍生物制备和光谱数据分析鉴定其结构.结果和结论从蛇足石杉中分离得到一新的faucettimane型生物碱,命名为蛇足石杉新碱(neohuperzinine).
关键词： 蛇足石杉 蛇足石杉新碱 faucettimane型生物碱 -
蛇足石杉鲨烯合酶HsSQS1基因克隆和序列分析
鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)是植物萜类化合物生物合成途径的关键酶.本研究根据课题组已获得的蛇足石杉(Huperzia serrata)转录组数据中的SQS1转录本序列,设计基因全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得蛇足石杉SQS1基因的全长cDNA序列；利用实时荧光定量PCR方法检测了HsSQS1基因在蛇足石杉根、茎、叶中的表达情况；对HsSQS1基因进行生物信息学分析,并预测HsSQS1编码蛋白的结构与功能.研究结果表明,克隆获得的蛇足石杉SQS1基因长为1263 bp,编码420个氨基酸,命名为HsSQS1,GenBank登录号JQ004938.HsSQS1基因在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶.本研究成功克隆并分析了蛇足石杉SQS1的全长序列,为进一步阐明蛇足石杉三萜代谢途径奠定基础.
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蛇足石杉不同生长阶段植株中石杉碱甲含量的地区差异及生境影响的比较观察
目的:调研蛇足石杉不同生长阶段植株中石杉碱甲含量的区域差异,探讨生境因子对石杉碱甲含量的影响.方法:调查江西修水县、贵州岑巩县、广西那坡县和重庆石柱县等4个样地的生境因子,采集样地中不同生长阶段的野生蛇足石杉植株材料(简称:材料),并用HPLC法测定其中的石杉碱甲含量.结果:①不同生长阶段材料中的石杉碱甲含量比较:幼苗＞幼株＞成株(江西、重庆样地),幼株＞幼苗＞成株(贵州、广西样地).②相同生长阶段不同样地材料中的石杉碱甲含量比较:幼苗期:4样地无明显差异;幼株期:贵州样地高,其他3样地差异不显著;成株期:贵州样地高,重庆其次,江西和广西样地差异不显著.③不同样地各生长阶段材料中石杉碱甲含量均值比较:贵州样地高为6.6(％),重庆样地其次为5.42(％),广西和江西低分别为4.83(％),4.47(％).④石杉碱甲含量与生境因子的关系:含量与年降雨量呈负相关关系,与海拔高度、年平均气温等无明显相关性.结论:①蛇足石杉幼苗和幼株中石杉碱甲平均含量均显著高于成株,不同样地之间平均含量存在显著差异.②生境因子严重影响蛇足石杉材料中石杉碱甲含量,其中较多的降雨不利于石杉碱甲的积累.
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超声波提取蛇足石杉内生真菌2F09P03B中石杉碱甲的研究
目的 确定一株蛇足石杉内生真菌2F09P03B发酵培养物中石杉碱甲的超声波辅助提取工艺,以改善石杉碱甲提取率.方法 对提取溶剂、pH值等影响提取效率的因素分别进行单因素实验;对料液比、超声波功率、负载率(duty cycle)、超声时间4个影响超声波提取效率的因素在单因素实验基础上利用正交实验进行优化.结果 超声波辅助提取石杉碱甲的佳工艺条件是:提取溶剂为pH 4.0的酸水,碱性还原反应在pH 7.5～8.O进行,料液比1:20,超声波功率140 W,超声波负载率30%,超声时间40 min.此条件下,该内生真菌石杉碱甲的提取率达0.074%,约为其他传统提取方法的1.5～2倍.结论 超声波辅助提取法的石杉碱甲提取率较其他方法有了显著提高,并能大幅度缩短提取时间,应在蛇足石杉内生真茵2F09P03B石杉碱甲的提取中加以应用.
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蛇足石杉中非生物碱类化学成分研究
目的 研究蛇足石杉Huperzia serrata全草的非生物碱类化学成分.方法 利用硅胶、反相硅胶、Sephadex HL-20等柱色谱进行分离纯化,通过核磁共振、质谱等谱学数据鉴定化合物结构.结果 从蛇足石杉二氯甲烷部位分离得到11个化合物,分别鉴定为千层塔烯二醇-21β-对二氢香豆酸酯(1)、千层塔烯二醇-3,21-二乙酸酯(2)、千层塔烯二醇-3-乙酸酯(3)、21-表千层塔烯二醇-3-乙酸酯(4)、3α,21β,24-千层塔烯三醇(5)、21-表千层塔烯二醇(6)、千层塔烯二醇(7)、16-羰基-3α,21β-千层塔烯二醇(8)、3β,21β,24-千层塔烯三醇(9)、16-羰基-3α,21β,24-千层塔烯三醇(10)、1-羟基二苯并呋喃醇(11).结论 化合物1～10均为石杉型三萜类化合物,化合物11为二苯并呋喃醇类化合物;其中1为新化合物,命名为千层塔型香豆酸酯,化合物2和11首次从该植物中分离得到.
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蛇足石杉内生真菌Penicillium chrysogenum MT-12中2个新二苯醚类成分
目的 研究蛇足石杉内生真菌Penicillium chrysogenum MT-12经固体发酵培养后的代谢产物.方法 利用硅胶、Sephadex LH-20及半制备液相色谱等方法进行分离纯化,根据化合物的理化性质及IR、MS、NMR等光谱数据鉴定化合物的结构;利用体外模型进行抗炎、乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选.结果 从P.chrysogenum MT-12固体发酵培养后的代谢产物中共分离鉴定8个二苯醚类化合物,分别为黄青霉内酯A(1)、黄青霉内酯B(2)、talaromyoneA(3)、isopenicillide (4)、penicillide (5)、hydroxypenicillide (6)、purpactinA(7)、黄青霉内酯C(8).结论 化合物1、2为新化合物,化合物3为首次从青霉属中分离得到,化合物4～8为首次从产黄青霉菌中分离得到;化合物1、2对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生有一定抑制活性,半数抑制浓度(IC50)值分别为(72.6±2.3)、(41.2±1.4) μmol/L,而所有化合物在100 μmol/L时对乙酰胆碱酯酶不显示抑制活性.
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蛇足石杉侧芽的发生与培养研究
目的 蛇足石杉Huperzia serrata自然繁殖能力低,资源极其匮乏,对蛇足石杉的快速繁殖技术进行探讨.方法 取活体茎尖,依次用多种消毒剂进行表面消毒,再用孔雀石绿及原子吸收光谱(AAS)联合杀灭内生真菌,得到无菌苗接种到1/2MS+25 g/L蔗糖的培养基中,无菌苗在二叉分枝后的新枝长到4～5 cm时剪下进行继代培养.结果 无菌苗分别在4次二叉分枝生长继代培养后,得到了数量不等的侧芽,侧芽的发生位置位于茎段中部或上部近茎尖处,侧芽的结构与芽孢的结构明显不同;不同植株培养获得的侧芽数不同,多的植株可产生14个侧芽,一个侧芽发生点可产生一个或多个侧芽;去除茎尖顶端优势后,茎段中部的侧芽生长速度加快;不同高度的侧芽拨离母株后,成活率差别大,5 mm以上的侧芽接种到1/2 MS+30 g/L蔗糖的培养基上,存活率可达90％,120 d后生长为2～3 cm的幼苗,低于5 mm的侧芽,拨离接种后死亡率较高.结论 蛇足石杉在离体培养中,可打破自然生长状态下叶腋内只产生孢子囊而不产生侧芽的生长方式,可形成多个增殖侧芽,侧芽剥离后极易产生不定根,为蛇足石杉的试管苗增殖方式提供重要参考.
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不同种质资源蛇足石杉引种及差异蛋白比较分析
目的 筛选野生蛇足石杉引种驯化的优质种质资源,并建立其分子鉴别方法.方法 对来自福建大田、三明市郊、南靖3个不同种质资源野生蛇足石杉引种驯化,HPLC法分析不同种质资源蛇足石杉中石杉碱甲(Hup A)量;采用蛋白质双向电泳技术,分析不同种质资源蛇足石杉差异蛋白.结果 种质资源来自大田的蛇足石杉适应性较强,植株长势好,成活率为65.5％,且茎叶HupA量也较高,分别为197.80和87.54 μg/g;遮阳成活率为77.8％,远高于未遮阳的成活率(7.1％);黄土地成活率为75％,远高于水田沙壤土的成活率(18.8％).不同种质资源蛇足石杉共有15个差异蛋白质点,不同种质资源蛇足石杉的差异蛋白质点丰度差异较大.结论 人工引种栽培时,土壤选择以黄土质为佳,并需要给予必要的遮阳;种质资源来自福建大田的蛇足石杉可以作为蛇足石杉优质种质资源进行引种驯化;利用蛇足石杉差异蛋白质点的丰度差异,可以作为鉴别不同蛇足石杉种质资源的依据.
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HPLC法测定蛇足石杉中石杉碱甲含量
目的考察蛇足石杉不同产地、不同部位中石杉碱甲(Hup A)和总碱含量;比较不同提取方法对石杉碱甲含量的影响.方法采用RP-HPLC法测定Hup A的含量.结果Hup A在根、茎、叶中的含量为茎、叶＞根;贵州、广东和安徽产地的Hup A含量分别为0.018%,0.021%,0.020%,提取方法之间差异不显著.结论Hup A含量在蛇足石杉中的分布为地上部分大于地下部分.不同产地Hup A含量有一定差异.
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蛇足石杉化学成分和药理作用研究进展
结合国内外文献综述蛇足石杉生物碱和三萜化学成分和药理作用,尤其重点归纳蛇足石杉石松生物碱的结构、类型.石杉碱甲为高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂,优于国外已上市的老年痴呆症治疗药物,是首先从蛇足石杉中发现的lycodine生物碱类型,从蛇足石杉分离的该类型其他生物碱也具有较强的类似活性,具备进一步研究与开发的潜力.
