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树舌灵芝工艺的研究
纤维素酶是多组分酶系的总称,各种酶协同作用可以降纤维素分解为寡糖和纤维二糖,终生成葡萄糖.纤维素酶被用来降解纤维素时,反应条件温和、特异性高且环境污染小.纤维素酶已广泛地应用于发酵工业、食品工业、燃料工业等各个方面.自然界的很多生物体内都产生纤维素酶,如细菌、真菌体内.现已报道的高产纤维素酶的真菌主要有木霉、青霉、黑曲霉,而研究大型真菌所产纤维素酶的报道却很少.大型真菌一般都可药用或食用,它不分泌有害物质,将其分泌的纤维素酶应用于食品或医药行业,市场前景看好.近年来,随着人们对灵芝药理学研究的越来越多,灵芝已成为开发功能性食品和药品的一种重要原材料.
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荧光定量RT-PCR试剂和反应条件对检测灵敏度的影响
目的 明确试剂和反应条件对荧光定量RT-PCR检测灵敏度的影响,为提高检测灵敏度提供指导.方法 将3种荧光定量RT-PCR试剂(A、B、C)和3种推荐反应条件(a、b、c)组合成9种荧光定量RT-PCR方法,采用统一的引物和探针,检测已知滴度的甲型流感病毒.通过对病毒进行10倍梯度稀释,测定不同方法的灵敏度,分析试剂、反应条件以及两者间相互作用对灵敏度的影响.结果 采用试剂C的3种方法是检测灵敏度低的方法(3种条件下灵敏度高于103 PFU/ml),3种试剂都在与条件b组合时都达到灵敏度的高值(试剂A、B、C分别达到100、100、103 PFU/ml),表明反应条件b可在一定程度提高方法的灵敏度.灵敏度高的方法是试剂B和条件b组合.结论 试剂和反应条件都对检测灵敏度有重要影响,但试剂的影响比反应条件更大;试剂和反应条件之间的相互作用对灵敏度也有一定影响.
关键词: 荧光定量RT-PCR 灵敏度 试剂 反应条件 -
新技术增强了过程化学的能力(Ⅱ)——平行实验帮助过程化学家优化生产路线
药物发现是否真正从组合化学和高通量筛选方法中获益,现在仍在争论之中.高通量实验和平行方法,对于研究合成路线、优化安全和成本有效的反应条件,却得到某些过程化学家的偏爱.高通量平行实验的益处包括:具有更高的生产效率、更广泛的实验空间、更多的信息,有时还能对正在发生的化学产生一些预想不到的认识.
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铁催化甲基紫褪色光度法测定水中痕量铁
催化动力学光度法测定痕量铁已有报道[1-4].我们发现一种新的指示反应,在稀硫酸介质中,痕量铁对过氧化氢氧化甲基紫褪色反应具有强烈的催化作用,其催化反应速度lg(A0/A)与Fe(Ⅲ)浓度之间符合动力学一级反应速率关系.据此,对该反应作了系统研究,探讨了各种反应条件,测定了反应在一定温度下的速度常数及反应的表观活化能.方法灵敏度为3.84×10-11 g/ml,线性范围为0~0.8 μg/25 ml.用于水中痕量铁的测定,获得满意结果.
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应用双重聚合酶链反应检测乙型、丙型肝炎病毒
常规聚合酶链反应(PCR)方法对患者HBV和HCV需要分别检测,因而操作繁琐,费时费力,且增加了污染的机会,为此,我们建立了双重PCR技术,实现一步法同时进行HBV和HCV的检测。 选取肝病患者血清标本115例,20例正常对照标本采自HBsAg阴性、肝功能正常的献血员。核酸提取采用蛋白酶K消化,酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,将提取的DNA和RNA复悬于焦碳二乙酯处理过的蒸馏水中,并加入2U RNA酶抑制剂Rnasin。PCR反应在核酸提取管中进行,总体积50μl,反应条件为10 mmol/L Tris·Cl(pH8.3),50mmol/LKCl,2mmol/LMgCl2,0.5μmol/L HBV和HCV引物,0.2 mmol/LdNITP,AMVRT逆转录酶2U,Tag DNA聚合酶2U,RNA酶抑制剂Rnasin 10 U,混匀。
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一株HIV1变异株的发现
我们在进行序列分析过程中发现一株不同于以往国内外报道的新型HIV1的变异毒株。现报道如下:1 材料和方法1.1 前病毒DNA的提取某HIV1感染者300μLEDTA抗凝血,使用Promega公司的DNA提取试剂盒(Wizard GenomicDNA Purification Kit)提取HIV1前病毒DNA。1.2 HIV env基因c2-v3区的套式PCR扩增 以所提的HW1前病毒DNA为模板,利用一对外侧引物EP1,EP2(序列为,EP1:5'-GGCAGTCTAGCA-GAAGAAGAGG-3':EP2:5'-CCTACTTC-C TGCCACATG-3')和一对内侧引物EP3,EP4(序列为,EP3:5'-GATCTGA-CAATTTCACGAACAAT TGC-3';EP4:5'-C TGGGTCCCCTCCTGAAGGATG-3')进行nested-PCR反应。反应条件为94qC30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃C5min结束扩增。1.3 PCR扩增片段的克隆P CR扩增的特异性片段经Promega公司的PCR产物纯化试剂盒(WizardPCRprepsDNA pu-rification system)纯化后,与PGEM-T载体连接克隆于JM109宿主菌中
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血清钙、镁的双项同测法及在HITACHI生化分析仪上的应用
双项同测法(analysis of two tests in one channel)是随着生化自动分析技术的进步而发展起来的一种高效、低耗、少污染、利于环保的绿色生化检测技术.它只需1份样品,1份试剂,在1个测试通道内可同时完成两项分析.血清钙、镁测定是临床常规检测项目,我们使用国内合成的2-(8′-羟基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-变色酸[2-(8′-quinolinol-5′-sulfo-7′-azo) -chromotropic acid,简称8Q5SAC]进行血清钙、镁的测定研究[1,2],结合HITACHI生化分析仪的功能特性,调整反应条件,建立了用于自动分析的血清钙、镁双项同测法,现予报道.
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肠癌细胞株dynamin Ⅱ的差异表达
目的:应用半定量RT-PCR方法检测dynaminⅡ基因在大肠侧向发育型肿瘤细胞株同SW480细胞株及Lovo细胞株之间的差异表达.方法:以三种肠癌细胞株为标本,分别提取总RNA,逆转录合成cDNA,选择加入的模板量及循环数,优化PCR反应条件,确定适宜的反应体系,凝胶图像分析结果.结果:在大肠侧向发育型肿瘤细胞株同普通隆起型肠癌细胞株之间存在着dynaminⅡ基因的差异表达.结论:半定量RT-PCR方法具有简单,方便,经济的特点,通过该方法,我们发现在大肠侧向发育型肿瘤癌细胞株同SW480细胞株及Lovo细胞株之间存在dynaminⅡ基因的差异表达,此结果同我们基因芯片的筛选结果一致,结合dynaminⅡ基因的功能,我们推测该基因可能在LST的形态学或癌变机制中发挥一定作用.
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乏氧条件启动HRE调控HSV-TK/GCV效应链对人肺腺癌A549细胞杀伤作用的观察
目的:观察由缺氧反应元件(HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统对乏氧环境中的人肺腺癌细胞系A549细胞的杀伤作用.方法:将HRE调控HSV-TK和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达的真核载体pHRE-TK通过脂质体导入A549细胞,分别在乏氧(O2浓度为3%)和常氧(O2浓度为21%)环境中培养,荧光显微镜观察重组载体转染A549细胞后报告基因EGFP表达变化,并进行荧光光密度(FOD)分析;再予以GCV处理5 d后,用MTT法检测GCV对培养细胞的杀伤效果.设立分别仅含有HRE、HSV-TK以及两者均无的3个荧光表达载体(pHRE、pTK、pEGFP)为对照组.结果:在乏氧环境中,由HRE调控的重组载体pHRE-TK和pHRE转染A549细胞后,其FOD值高于无HRE调控的载体pTK和pEGFP转染组P<0.01;而在常氧环境中各组细胞之间FOD值差异无统计学意义,P>0.05.携带HSV-TK基因的重组载体pHRE-TK和pTK转染A549细胞后,细胞对GCV的敏感性均高于无HSV-TK基因的pHRE组细胞,P<0.01;敏感性随GCV浓度增加而增大.在乏氧环境中培养的pHRE-TK组细胞对GCV的敏感性高于pTK组(P<0.01),亦高于在常氧环境中培养的pHRE-TK组细胞,P<0.01;而在常氧环境中,pHRE-TK组与pTK组细胞对GCV的敏感性差异无统计学意义,P>0.05.结论:在乏氧的A549细胞内,HRE使报告基因EGFP表达增强;HRE能增强HSV-TK/ GCV系统对乏氧环境中的A549细胞的杀伤效率.
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2-(4-甲氧苯基)-1,5-(苯并硫氮杂)-3,4-(2 H ,5 H )-二酮(MBD)的合成研究
MBD是合成地尔硫(diltiazem,钙拮抗剂类心血管药物)的重要中间体。其合成路线如下: 表面看,其步骤简单,但包括了脱乙酰基、酸化和互变异构体转化三步反应,且产物在温度稍高、酸性太强的溶液中,易受空气氧化变色。因此,反应条件的掌握和后处理方法严重影响产品的收率及工业化生产的可行性。原文献方法的反应条件不易控制,我们重复多次实验,收率不稳(38%~63%)、后处理繁琐、乙醚用量较大、不宜用于工业化生产。 本文经多次摸索改进了实验方法:(1)将第一步反应温度控制在22~25 ℃,避免了产物因高温变色,低温析出(不利下一步酸化),又保证了反应的完全;(2)在酸化一步,摸索了佳的中和pH值(4~5),使MBD成为主产物,减少了烯醇式(Ⅲ)的含量,并避免了pH值偏低后,反应液变红色,增加杂质的问题;(3)溶剂的极性对互变异构体中两者的比例有一定影响。我们在酸化一步中加入了适量的甲醇,降低了原溶液的极性,并探索了酸化后烯醇式与酮式的转型时间
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原子荧光光谱法同时测定深井水中砷和汞
原子荧光光度计同时测定生活饮用水中As、Hg的技术,就仪器本身的性能、佳氢化反应条件、干扰等方面进行了测试,同时就检测过程中应注意的问题,供同行参考并提出建议.在正常情况下有害元素含量很低,对人体无害,但当有害元素含量达到一定量时,就会对人体造成伤害,所以对生活饮用水的准确检测就非常重要.
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基因芯片用于检测缺失型α地中海贫血
地中海贫血(珠蛋白生成障碍性贫血,地贫)是我国长江以南发病率高、危害大的一种遗传病.我国南方地区常见的3种缺失型α地贫分别是由-α3.7、-α4.2和--SEA基因的缺失引起的.传统的缺失型α地贫基因分析检测方法主要是用Southern杂交、聚合酶链反应(PCR)法.但由于α地贫珠蛋白基因缺失型的不同所需试剂及反应条件也不同,须分别进行检测,给临床筛查及快速诊断带来不便;同时,全套检测的累加费用较高,给患者造成了一定的经济负担.近年来基因芯片技术的发展给疾病的基因诊断提供了广阔的应用前景.我们运用基因芯片技术,完成了40份已知基因分型血液样品的基因诊断,报道如下.
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饮用水中耗氧量测定影响因素分析
饮用水中耗氧量检测方法严格执行酸性高锰酸钾滴定法,因酸性高锰酸钾滴定法属于氧化还原反应类型,其氧化程度和反应机制比较复杂,准确测定往往比较难做,本研究通过实验中严格掌握反应条件、高锰酸钾标准溶液的浓度、准确控制加热时间和滴定温度及滴定速度,对测定结果的影响进行分析,总结了在测定过程中的几点注意事项,对耗氧量的准确测定具有重要作用.
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食品中砷的氢化物原子荧光法测定
为了探讨AFS-230E全自动双道原子荧光光谱仪的性能佳反应条件,干扰因素等,本文采用氢化物原子荧光法对食品中微量砷进行了测定.该方法具有操作简单、快速、干扰少、灵敏度高、线性范围宽等优点.该方法的检出限为4.25μg/kg,线性范围0~100 ng/ml
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食源沙门菌DNA环介导恒温核酸扩增法检测
沙门菌是食源性致病菌中一个主要的属,在各类细菌性食物中毒事件中,沙门菌造成的食物中毒位居前列[1.2].常规的沙门菌检测方法费时费力,已经不能满足食品生产质量控制的要求[3].因此,需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法.Notomi等开发出一种新的恒温核酸扩增法一环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification ofDNA,LAMP)[4,5].本研究利用DNA环介导恒温核酸扩增法对市售不同生肉来源的沙门菌进行快速检测,并且着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行验证,以建立的IAMP反应条件能够对今后病原微生物的检测研究工作提供参考依据.
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快速肥达反应的实验研究与临床应用
本研究采用微波、离心等方法处理肥达反应的抗原抗体反应体系,旨在改进其反应条件,以期达到快速、敏感诊断肠热症的目的.
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戊二醛消毒剂含量测定的影响因素探讨
戊二醛作为常用的医用消毒剂具有灭菌效能高、杀菌力强的特点,尤其是质量分数为2.0%的戊二醛消毒液具有强大的杀灭细菌、病毒及芽孢的作用,被广泛应用于医院的医疗器械消毒工作中. 但质量分数低于2.0%的戊二醛溶液,无论怎样延长杀菌时间,也不能取得可靠的杀灭细菌芽孢的效果[1] ,因此对戊二醛含量的测定就显得尤为重要. 目前,卫生部2002年版枟消毒技术规范枠中规定了用羟胺法来测定其浓度含量,但盐酸羟胺法会受很多反应条件的干扰而影响结果的判定[2] ,因此,我们对现行测定方法进行了反复多次试验,以期了解影响其结果判定的因素,从而能有效控制测定结果的准确性.
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大鼠肝脏常规Feulgen反应佳反应条件的定量探讨
Feuglen反应是科学研究和临床病理等工作中常用的组织化学反应,对DNA的显示具有特异性,可用于核酸的定量化测定,然而目前对该反应的认识仍是比较模糊,对结果的判断多带有主观随意性,为了对Feulgen反应过程有更全面的、定量化的认识,使反应条件更加客观,结合科研和教学工作的需要,我们利用图分析仪对这一反应的某些不同实验条件进行了初步测定,试图确定比较适用的、客观的反应条件。1 材料和方法 取正常Wistar大鼠肝脏,Camoy液固定2小时,常规石蜡包埋,切片厚6 μm,另取大鼠肝脏,冷冻切片,Canoy液固定15分钟,吹干待用。盐酸水解条件分为三种情况:(1)石蜡切片1N盐酸60℃,8分钟;(2)石蜡切片5N盐酸,室温。
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血清透明质酸时间分辨荧光免疫分析法的反应条件优化及其临床应用
目的 优化血清透明质酸(HA)时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)的反应条件,并探讨其临床应用价值.方法 采用TRFIA检测血清中HA的含量,确定参与HA-TRFIA的各反应成分的浓度.结果 佳反应条件为包被浓度10 mg/L、HA 结合蛋白(HABP)1∶ 500稀释、铕标记HA(Eu3+-BSA-HA)1∶ 200稀释.敏感性为5.17 μg/L,批内变异系数(CV)为2.21%~3.78%, 批间CV为3.73%~5.40%,平均回收率为100.4%.该法HA测定值与放射免疫测定值显著相关,且与临床结果一致.结论 本研究建立的血清HA-TRFIA是一种灵敏准确的分析方法,适合临床应用.
关键词: 时间分辨荧光免疫分析法 反应条件 优化 透明质酸 -
斑点免疫渗滤法检测抗精子抗体的反应条件优化
近年的研究显示,精子膜抗原与生育关系密切,其抗体的产生可导致免疫性不育.目前比较快速的抗精子抗体(AsAb)检测法是斑点免疫渗滤法,但经与酶免试剂盒相比,市售的胶体金免疫渗滤试剂盒灵敏度不十分理想.因此,我室用自己提取的精子膜抗原,建立了快速检测AsAb的实验方法.