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鼠疫菌caf1基因特异性片段的克隆表达及其抗原与抗体反应
目的 克隆表达鼠疫菌caf1基因上的特异性片段并检测.方法 分别选取F1上C端(caf1-C)及N端(caf1-N)两段B细胞表位进行克隆表达;PCR扩增目的基因,并与表达质粒pET32a(+)进行连接,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)并诱导表达;表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并以Western-blot法检测其抗原与抗体反应.结果 分别诱导表达出大小为26000的Caf1-C和25000的Caf1-N两个片段,2个重组蛋白均以可溶形式存在,并与鼠疫免疫血清有良好的反应.结论 克隆表达出具有抗原与抗体反应的鼠疫菌F1抗原上的两段B细胞表位,为鉴定是否是F1位点交叉奠定了基础.
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用双重式聚合酶链反应技术检测鼠疫菌的实验研究
近几年来,随着分子生物技术的迅猛发展,国内外学者对聚合酶链反应(PCR)用于鼠疫的检测十分关注.Hinnebusch等[1](1993)用Pla基因序列,以特异性片段为引物,建立了检测印鼠客蚤体内鼠疫菌的PCR方法.Hiroko氏等[2](1996)用多引物PCR,对鼠疫菌检测进行研究.本文采用双引物PCR法对云南自50年代起至今从现场不同来源的部分菌株进行了实验,建立起适于当前鼠疫快速诊断之方法.
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一株HIV1变异株的发现
我们在进行序列分析过程中发现一株不同于以往国内外报道的新型HIV1的变异毒株。现报道如下:1 材料和方法1.1 前病毒DNA的提取某HIV1感染者300μLEDTA抗凝血,使用Promega公司的DNA提取试剂盒(Wizard GenomicDNA Purification Kit)提取HIV1前病毒DNA。1.2 HIV env基因c2-v3区的套式PCR扩增 以所提的HW1前病毒DNA为模板,利用一对外侧引物EP1,EP2(序列为,EP1:5'-GGCAGTCTAGCA-GAAGAAGAGG-3':EP2:5'-CCTACTTC-C TGCCACATG-3')和一对内侧引物EP3,EP4(序列为,EP3:5'-GATCTGA-CAATTTCACGAACAAT TGC-3';EP4:5'-C TGGGTCCCCTCCTGAAGGATG-3')进行nested-PCR反应。反应条件为94qC30s,55℃30s,72℃30s,35个循环;72℃C5min结束扩增。1.3 PCR扩增片段的克隆P CR扩增的特异性片段经Promega公司的PCR产物纯化试剂盒(WizardPCRprepsDNA pu-rification system)纯化后,与PGEM-T载体连接克隆于JM109宿主菌中
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半夏凝集素基因的克隆与氨基酸序列初步分析
目的 克隆半夏凝集素基因并对其氨基酸序列生物信息与已报道相关基因进行对比分析,为抗虫基因利用和转基因育种研究奠定基础.方法 根据已报道的植物凝集素基因序列设计特异引物,以半夏叶片DNA为模板进行PCR扩增,获得特异性片段,将其连接到测序载体上,进行序列测定,用分析软件分析序列信息.结果 克隆1 069 bp的半夏凝集素基因(pta),开放阅读框全长804bp,编码268个氨基酸残基;预测相对分子质量和等电点分别为2.91×104和7.77,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区;已在GenBank中登记(登录号AY725425).结论 克隆的半夏凝集素基因序列信息完整,具有典型的甘露糖结合位点,可以作为抗虫基因用于抗虫育种.
关键词: 半夏 半夏凝集素(PTA) 基因克隆 序列分析 特异性片段 -
都匀市亚洲牛带绦虫病感染危险因素分析
亚洲牛带绦虫(Taenia Saginata asiatica)的发现和命名是近30年来绦虫研究的新进展之一.中国学者近年来经过染色体细胞色素细胞氧化酶Ⅰ(COI)基因特异性片段PGR扩增和序列分析[1],进行感染猪、牛的生物学、生化、病理[2-4]及病原学[5]等相关研究,均证实都匀牛带绦虫为亚洲牛带绦虫,但缺乏进行深入的流行原因调查.为此,本文对都匀亚洲牛带绦虫病人相关饮食卫生、膳食行为和习惯等因素进行调查,以期为亚洲牛带绦虫防治提供依据.
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巢式PCR检测阿萨希丝孢酵母DNA
阿萨希丝孢酵母(Trichosporon asahii,T.asahii)是引起毛孢子菌病的主要病原菌.我们在2000年报道了国内首例播散性毛孢子菌病[1],其后在另一家医院也发现肺部T.asahii感染.该病不仅可有广泛的皮肤损害,还可引起肝、脾、肾、肺等内脏损害,死亡率高达80%以上.由于该病少见,临床医生很少将皮损活检标本及肝穿组织直接送做真菌培养,而多首选普通病理检查.在患者需要补充检查和回顾性诊断时,蜡块组织往往是惟一可以得到的标本.因此,如能通过蜡块组织扩增T.asahii DNA特异性片段来诊断T.asahii感染具有重要的临床意义.
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问号钩体黄疸出血群赖型赖株特异性基因的筛选
通过抑制消减杂交技术,比较问号钩体黄疸出血群赖型赖株与双曲钩端螺旋体57001株之间基因组的差异,筛选致病钩体特有的基因片段.主要方法为以问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株为tester,非致病性双曲钩端螺旋体57001株为driver,培养后分别抽提基因组DNA,经Alu Ⅰ酶切后连接特殊设计的adaptor进行消减杂交和PCR,获得的消减混合物经T/A克隆后,转化入pMD18中建立消减杂交文库.经PCR和dot blot筛选鉴定阳性克隆,并进行测序及同源分析.结果显示在随机挑取的188个克隆中,有35个含有tester特异的DNA序列.特异性片段测序后进行生物信息学分析,发现.本研究筛选并分析了可能与钩体毒力相关的基因.为进一步探讨该基因地生物学功能及阐明问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株致病分子机制打下了基础.
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人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究
目的 环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之 一. 本研究旨在获得hCOX-2 编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染COX-2高表达的胃癌 细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制. 方法 按文献报道的hCOX-2 核苷酸序列设计合成PCR引物,利用总RNA抽取试剂盒从COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SGC 7901中提取细胞总RNA,反转录合成cDNA,再用PCR方法扩增目的基因序列. PCR产物经DNA序 列测定证实后,利用引物5端引入的EcoRⅠ, XbaⅠ酶切位点,通过粘端连接,将 所获目的 基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中. 对两种重组质粒分别进 行相应的酶切鉴定. 采用脂质体介导的方法用COX-2反义核酸转染SGC7901细胞,经G418筛 选 后,随机挑选细胞克隆. 通过RT-PCR检测COX-2 mRNA水平的变化. 结果 应用RT-PCR反应扩 增获得大小约1.9 kb的特异性片段. 经DNA序列分析,证实与文献报道的hCOX-2编码区序列 一致. 重组正义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(+)用EcoRⅠ,XbaⅠ双酶切后,产生大 小约5.4 kb,1.9 kb的片段;重组反义表达载体pcDNA3.1/hCOX2(-)通过PstⅠ酶切, 产 生大小约4.5 kb, 1.5 kb与1.3 kb的片段,与预期结果相符. 转染细胞经筛选后,随机挑选 、扩增了3个细 胞克隆,其中1个细胞克隆稳定表达COX-2反义核酸,RT-PCR提示其COX-2 mRNA水平显著 下 降. 结论 成功克降了hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表 达载体. 反转录PC R是克隆基因的简便、有效方法. 为扩增高GC含量的cDNA模板,可在PCR引物中加入限制性内 切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆. COX-2反义核酸在胃癌细胞系SGC7901中得到 稳定转染,转染细胞COX-2 mRNA表达显著受抑制.