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p53基因诱导表达可调控细胞系的构建
p53基因是被广泛关注的抑癌基因,50%以上人类癌症中都检测到p53基因突变[1,2].p53基因研究已取得很大进展,但有关其作用的具体生理生化通道还不十分清楚,解决这个问题的关键是进行p53下游基因的克隆,了解下游事件,弄清信息传递途径.p53基因过度表达导致细胞生长停滞或程序性死亡,很难获得足够的能表达p53基因的细胞作为克隆其下游基因的材料.本研究采用哺乳动物基因诱导表达系统--Tet-OnTM基因表达系统[3],构建p53基因诱导表达可调控细胞系,为直接克隆p53下游基因并对其功能研究奠定了基础.
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利用Tet-OnTM基因表达系统直接克隆p53下游基因
目的直接克隆p53下游基因,并对其功能进行初步研究.方法采用哺乳动物细胞诱导表达系统-Tet-onTM基因表达系统,建立p53基因诱导表达可调控的细胞系;通过mRNA差异显示技术直接克隆p53下游基因,并利用原位杂交技术检测其在小鼠胚胎发育过程中的表达.结果克隆到一个新的p53下游基因侯选基因,并检测到它在小鼠胚胎发育过程中有特异性表达.结论直接克隆p53下游基因的成功,为进一步研究p53基因的功能奠定了基础.
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炎症反应相关基因诱导表达的信号转导及其负相调节
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卡介苗胞壁蛋白诱导人肺腺上皮细胞hBD-1 mRNA表达及其抗菌活性的增强
目的:旨在分离和鉴定刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)β-防御素-1(hBD-1)基因表达的卡介苗胞壁活性蛋白,为开发增强粘膜抗菌肽基因表达的免疫增强剂以防治粘膜感染的研究打下基础.方法:采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、Sephadex G-150柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Northern杂交检测SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达;采用琼脂糖弥散杀菌法检测SPC-A-1细胞培养上清的抗菌活性.结果:RT-PCR和Northern杂交分析均证实卡介苗刺激SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达增强了2倍.卡介苗胞壁蛋白Sephadex G-150层析所得6个组分中,组分5(分子量范围约21×104-29×104)诱导SPC-A-1细胞hBD-1 mRNA的表达增强4倍,其培养上清的抗菌活性显著增强.这种诱导作用具剂量和时间依赖关系.结论:结果提示卡介苗胞壁蛋白是β-防御素基因诱导表达的一新的激活因子.
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炎症反应相关基因诱导表达的信号转导与新药研发的展望
炎症本质上是机体细胞对有害刺激(包括生物、化学和物理性刺激)做出的保护性反应,但是炎症也应该被视为一柄"双刃剑",一方面对机体起到保护作用,另一方面也可能造成组织器官损伤.因此几乎在机体产生炎症反应的同时,就要启动抑制炎症的机制以控制炎症反应的强度,避免或减弱自身的损伤.炎症反应相关基因属于快速反应基因类型,可通过参加炎症信号转导通路被诱导表达,且是一个可调控的反应过程.近年来我们课题组对炎症反应相关基因表达的正相与负相调节进行了研究,现综述如下,并展望在新药研发中的应用.
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香菇多糖诱导人肺腺上皮细胞β-防御素-2基因表达的研究
探讨香菇多糖诱导人肺腺上皮细胞的人-β-防御素-2(HBD-2)基因表达的情况.香菇多糖体外刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)后,应用RT-PCR技术检测SPC-A-1细胞HBD-2 mRNA的表达.香菇多糖可上调人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)HBD-2mRNA的表达;这种增强表达与药物的刺激剂量和刺激时间具有一定的相关性.
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板蓝根诱导人肺腺上皮细胞β-防御素-2基因表达的研究
目的 研究板蓝根体外刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)是否诱导表达具有抗菌活性的人-β-防御素-2(HBD-2)表达,并进一步探讨该表达是否存在浓度和时间依赖性效应,为进一步在动物水平探讨HBD-2的表达与中药之间的量效关系及时效关系提供依据.方法 体外培养SPC-A-1细胞,设置板蓝根5个浓度梯度,另设阳性对照和空白对照各1个,分别刺激贴壁生长的SPC-A-1细胞,应用RT-PCR技术检测SPC-A-1细胞HBD-2mRNA的表达情况,获取佳表达浓度;再以佳浓度经不同时间点刺激SPC-A-1细胞,得到表达诱导时间和持续时间.结果 研究显示板蓝根能够上调(SPC-A-1)细胞HBD-2mRNA的表达,且这种表达与板蓝根具有浓度和时间依赖性,当浓度为100μg/ml,刺激8h时,HBD-2mRNA的表达达到高.结论 板蓝根可诱导HBD-2基因的表达,当浓度为100μg/ml,刺激8h时,其表达达到高.