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急性重症胰腺炎血液滤过治疗的机制
目的:探讨血液滤过减轻急性重症胰腺炎(SAP)全身炎症反应的机制.方法:逆行性胰管注射50 g/L牛黄胆酸钠/自身胆汁制备犬SAP动物模型,2 h后实施血液滤过2 h,并设立对照组(制模后仅给予深静脉穿刺插管而不血液滤过).记录不同时间段心率,12 h处死动物后通过病理学评分评价肺、肝脏和胰腺组织损伤情况,Westen blotting法检测肺和肝脏组织核转录因子NF-κB的核移位及RT-PCR检测肿瘤坏死因子TNF-αmRNA表达,通过比较血滤组和对照组脏器组织炎性激活和损伤的情况,分析血液滤过的作用机制.结果:血滤前心率两组之间无显著差异,血滤后各时间点均为对照组显著高于血滤组.病理学评分显示血滤减轻肺脏的损伤,而对肝脏和胰腺损伤作用不明显.NF-κB核移位和TNF-α mRNA表达均为血滤组低于对照组.结论:血液滤过减轻肺、肝脏等远离病灶器官的炎症激活和损伤,这一作用可能同血液中致炎因子的滤过清除有关.
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Syk(L)细胞核移位现象对乳腺癌细胞侵袭力的影响
目的 探讨2种Syk蛋白异构体在乳腺癌细胞中的表达、细胞亚细胞器中分布和对乳腺癌细胞侵袭力影响.方法 采用Western blot方法检测6种乳腺癌细胞系中Syk的表达;采用胞核、胞浆分离试验及质粒定点突变技术检测2种Syk蛋白异构体在细胞亚细胞器中的分布并探讨Syk(L)的核移位机制;采用体外侵袭力实验研究2种Syk蛋白异构体和DEL域碱性氨基酸突变成非碱性氨基酸的Syk(L)对肿瘤细胞侵袭力的影响.结果 2种Syk蛋白异构体在4种乳腺癌细胞系中同时表达;Syk(L)在乳腺癌细胞中的表达可明显抑制细胞的侵袭力,Syk(S)对侵袭力无影响;在同时表达2种Syk蛋白的乳腺癌细胞系MB468及分别表达Syk(L)、Syk(S)的稳定细胞株MB435中,只有分子量较大的Syk(L)可从胞浆移位到胞核内.DEL域内的碱性氨基酸被突变为非碱性氨基酸后,Syk(L)失去核移位功能,亦不能抑制乳腺癌细胞的侵袭力.结论 Syk(L)-DEL域内的碱性氨基酸具有核定位信号功能,Syk(L)的核移位现象与其抑制乳腺癌细胞侵袭力功能密切相关,Syk(L)的抑癌功能是由它移位到细胞核内行使的核蛋白相关功能决定的.
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YB-1蛋白在结肠癌组织中的表达部位及意义
目的：探索YB-1蛋白在结肠癌组织、正常结肠组织、结肠癌细胞株、正常结肠细胞株中的表达量及其与结肠癌患者临床病理的关系。方法：采用免疫组化检测YB-1蛋白在103例结肠癌组织及相应癌旁组织、30例正常结肠组织中的表达情况；采用Western blot法检测核移位YB-1蛋白在结肠癌组织、相应癌旁组织、正常结肠组织、人结肠腺癌细胞株LS-174T、正常细胞株SW480中的表达。结果：免疫组化结果显示YB-1蛋白主要表达于癌细胞胞浆，其阳性率为（75.73%，78/103），明显高于癌旁组织（37.86%，39/103）及正常组织（30%，9/30），其差异有统计学意义（P＜0.05）。其中37例（35.92%，37/103）结肠癌组织伴有明显核阳性表达，且核阳性表达与结肠癌肿瘤直径大小、有无淋巴结转移、有无远处转移或直接侵犯及癌细胞分化程度相关（P＜0.05）。Western blot检测同样证实核移位YB-1蛋白在结肠癌组织中（0.382±0.095）明显高于癌旁组织（0.251±0.043）及正常结肠组织（0.238±0.045），其差异有统计学意义（F=21.268，P＜0.05）。核移位YB-1蛋白在LS-174T中的表达（0.548±0.031）明显高于SW480（0.269±0.017），其差异有明显统计学意义（F=64.273，P＜0.05）。结论：YB-1蛋白量的变化与核转移及结肠癌细胞的增殖分化密切相关，有可能成为结肠癌治疗的新靶点。
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核内表皮生长因子受体的作用及与肿瘤关系
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)作为膜受体在许多肿瘤组织细胞中高表达,在细胞膜表面与其配体结合发挥生物学效应,促进细胞增殖、血管生成、侵袭和转移等.然而近年在许多肿瘤组织细胞核内发现EGFR,进一步研究表明核内EGFR表达阳性的肿瘤恶性度高、侵袭力强,抵抗化疗和放疗,且核内EGFR表达水平的高低与肿瘤预后相关.本文就核内EGFR的转运、功能、作用机制以及与肿瘤的关系等方面的研究做一综述.
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STAT4的DNA结合域中395～416位氨基酸残基序列参与IL-12介导的STAT4入核
本研究旨在探讨信号转导和转录活化蛋白4 (signal transducer and activator of transcription 4,STAT4)受白介素-12 (interleukin-12,IL-12)剌激后移位入细胞核的机制.对STATs家族成员进行同源性比对分析结果显示,STAT4的DNA结合域的395～416位氨基酸残基序列可能具有二聚体特异性核定化信号(dimer-specific nuclear localization signal,dsNLS)功能.有鉴于此,本研究以pEGFP-C1为表达载体,分别构建了pEGFP-STAT4质粒、缺失395～416位氨基酸残基序列的缺失型STAT4质粒(pEGFP-STAT4-Del)、将SV40大T抗原上经典的NLS核酸序列插入表达载体的阳性对照质粒(pEGFP-NLS)和将缺失型STAT4插入pEGFP-NLS的pEGFP-NLS-STAT4-Del质粒.将这些质粒瞬时转染宫颈癌腺癌细胞系Caski细胞,经过IL-12刺激,发现野生型STAT4移位入细胞核,而缺失型STAT4分布在细胞浆中；进一步用leptomycin B处理,IL-12再刺激后野生型STAT4被滞留于细胞核中,而缺失型STAT4仍然分布在胞浆中；将NLS插入缺失型STAT4,能恢复缺失型STAT4的核移位.以上结果说明野生型STAT4在1L-12刺激下能移位入细胞核,其入核机制是在其DNA结合域的395～416位氨基酸残基序列具有dsNLS功能,能介导活化的STAT4移位入细胞核.
关键词： 核移位 核定位信号 信号转导和转录活化蛋白4 -
核移位YB-1蛋白、P-gp及PCNA在肝癌中的表达及意义
目的 探讨核移位YB-1蛋白、P糖蛋白(P-gp)、增殖核抗原(PCNA)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其在肝癌发生发展中的作用.方法 采用免疫组化法检测YB-1、P-gp、PCNA蛋白在58例HCC组织、20例正常肝组织中的表达.结果 在肝癌组织中核移位YB-I与P-gp、PCNA蛋白阳性率分别为31％ (18/58)、83％ (48/58)、100％ (58/58),与正常肝组织相比有显著差异(P＜0.05).核移位YB-1蛋白及PCNA积分与肝癌病理分级、门静脉癌栓、肿瘤大小有关(P ＜0.05)；P-gp蛋白与肝癌病理分级有关(P＜0.05).核移位YB-I蛋白与P-gp、PCNA蛋白表达呈正相关(P＜0.05).结论 YB-1蛋白可能通过核移位途径上调P-gp、PCNA蛋白表达,从而促进肝癌的发生发展及其恶性表型的维持,YB-1蛋白有可能成为肝癌治疗的新靶点.
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酪氨酸激酶Syk两种蛋白异构体在乳腺癌细胞内的分布
目的 观察长脾脏酪氨酸激酶[Syk(L)]和短脾脏酪氨酸激酶[Syk(S)]在乳腺癌细胞中的分布.方法 采用胞核、胞质分离技术和Western blot的方法检测乳腺癌细胞系BT474和MB468中两种Syk蛋白异构体的细胞内分布.构建表达Syk(L)或Syk(S)的MB435稳定细胞克隆,采用细胞胞核、胞质分离方法和免疫组织化学的方法观察Syk(L)及Syk(S)在细胞内的分布.结果 在乳腺癌细胞系BT474和MB468中,Syk(L)在细胞质、细胞核内均有表达,Syk(S)只表达在细胞质中.MB435-Syk(L)稳定细胞株中的Syk(L)在细胞质、细胞核内均有表达,MB435-Syk(S)稳定细胞株中的Syk(S)只分布在细胞质内.结论 在乳腺癌细胞中,Syk(L)可由细胞质移位到细胞核内,而Syk(S)只存在于细胞质中.Syk(L)的抑癌功能可能与它的细胞核内功能有关.
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核表皮生长因子受体在肿瘤发生发展和治疗耐受中的作用
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)作为膜受体在许多肿瘤组织细胞中具有促进细胞增生、血管生成、侵袭和转移的作用.然而,对核EGFR转导途径及其功能的研究表明:核EGFR作为一个新的转录因子在肿瘤的形成、发展、转移及治疗耐受中发挥着重要的生物学功能,特别是核EGFR能促进细胞生成和促进DNA修复,以及使肿瘤细胞耐受化疗和放疗的作用.因而,针对EGFR的分子靶向治疗具有重要的实际意义.
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NF-κB在过氧化氢所致心肌细胞凋亡的作用
目的和方法:本文试图证明:NF-KB信号通路的激活可能介导了过氧化氢(H2O2)所致的心肌细胞凋亡,实验用体外培养的新生Wistar大鼠心肌细胞,随机分为三组:1.正常对照组(37℃,3 h);2. H2O2(1 mmol/L)损伤组(37℃,24 h);3.热休克预处理(43℃,1 h,37℃恢复6 h)+H2O2(1 mmol/L)损伤组(37℃,3 h).采用末端标记法及流式细胞仪检测凋亡发生,Western-blot检测H2O2(1 mmol/L)损伤5 min,15 min, 30 min, 60 min后I-κΒα量的变化及热休克预处理对这种变化的影响,免疫组化检测H2O2(1 mmol/L)损伤0.5 h后心肌细胞中NF-κB的分布情况及热休克预处理的作用.结果:1.H2O2(1 mmol/L)损伤24 h后,末端标记法发现大量凋亡细胞,流式细胞仪发现细胞凋亡率明显增加,而热休克预处理可明显减轻H2O2引起的心肌细胞凋亡(P＜0.01);2.Western blot显示I-κBα在H2O2(1 mmol/L)损伤5 min即减少,15 min减至低,而后逐渐恢复,而热休克预处理可抑制H2O2引起的I-κBα降解;3.免疫组化显示正常心肌细胞NF-κB分布于胞浆中,H2O2(1 mmol/L)损伤0.5 h则移位于胞核中,而热休克预处理可抑制H2O2引起的NF-κB向胞核移位.结论:H2O2可诱导心肌细胞发生凋亡,而NF-κB的激活可能在其中发挥重要作用.
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在活细胞上研究核定位信号介导核移位的方法
目的 建立一种在活细胞上研究核定位信号(NLS)介导核移位机制的新方法.方法 利用67 mg/L 3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)处理细胞后,用1g/L麦胚凝集素(WGA)与细胞孵育,来观察能否阻断干扰素γ(IFN-γ)诱导的信号转导子和转录激活子1(STAT1)移位入核.结果 CHAPS处理细胞后,对于IFN-γ本身诱导的STATI核移位没有影响,而进一步用WGA处理则阻断了IFN-γ诱导的STAT1核移位.结论 利用CHAPS在细胞膜上打孔的方法,建立了一种简单有效的、在活细胞上研究NLS介导核移位机制的新方法.
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应用GFP质粒构建及转染技术探讨Syk(L)核移位机制
[目的] 通过研究Syk(L)在乳腺癌细胞亚细胞器中的分布和移位机制,探讨Syk(L)抑制乳腺癌的可能性机制.[方法] 采用细胞胞核、胞浆分离技术和Western blot的方法,检测乳腺癌细胞系BT474中两种Syk蛋白异构体在细胞内的分布.构建绿色荧光蛋白(GFP)和Syk(L)核移位相关功能域融合蛋白质粒,转染入Cos 7细胞内,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞内的分布.[结果] BT474细胞的细胞浆中可检测到Syk(S)和Syk(L)的表达,细胞核中只检测到Syk(L)的表达.在Cos 7细胞中,GFP与Syk(L)的缺失域(deletion domain,DEL域)融合蛋白均匀分布于细胞内,GFP与Syk(L)的IDB域融合蛋白聚集于细胞核中;将DEL域上的294K、300K、及305K突变域非碱性氨基酸后构建成GFP-IDB(L)-M,突变的融合蛋白则失去核聚集现象.[结论] 在乳腺癌细胞中,Syk(L)可从细胞胞浆移位到细胞核内.Syk(L)的IDB域具有完整的核移位功能,能将融合的胞浆蛋白GFP转移到细胞核内;DEL域的碱性氨基酸具有核定位信号功能.Syk(L)在乳腺癌细胞中的抑癌功能与其核移位有关.
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三羟异黄酮对人乳腺癌细胞端粒酶的影响
目的 研究三羟异黄酮(Genistein,Gen)对人乳腺癌细胞系体外增殖的影响及其与端粒酶的关系.方法 体外培养雌激素受体阳性(ER+)和阴性 (ER-)乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,MTT法检测细胞增殖的影响;RT-PCR法观察端粒酶逆转录酶TERT基因mRNA的表达;免疫细胞化学染色观察NF-κB p65的核移位.结果 雌二醇(Estradiol,E2)单独作用时,促进MCF-7细胞增殖、TERT mRNA表达和NF-κB p65的核移位,但对MDA-MB-231细胞无明显影响.低剂量的Gen对MCF-7细胞的单独作用与E2类似,与E2联合作用时,MCF-7细胞无明显变化;高剂量的Gen单独或联合E2作用于 MCF-7细胞以及MDA-MB-231细胞,均表现为抑制细胞增殖、TERT mRNA表达和NF-κB p65的核移位.结论 Gen对两种乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖的不同影响与雌激素受体表达状态及E2存在与否有关,并可能是通过调节TERT的mRNA表达、NF-κB p65的核移位来调控细胞端粒酶活性的.
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双岐杆菌胞壁蛋白诱导人肠上皮细胞β-防御素-2基因的表达及NF-κB的活化
本研究应用超声破碎和离心法分离获得双岐杆菌胞壁,2%SDS提取其胞壁蛋白,superdex-200柱层析获得多个蛋白组分.RT-PCR和Northern杂交检测到双岐杆菌全菌、胞壁、胞蛋白均可诱导人肠上皮细胞株HT-29 and Caco-2细胞表达人β-防御素-2(HBD-2)mRNA的显著表达.为了在蛋白质水平上检测其基因的增强表达,构建了HBD-2基因原核表达载体,并制备获得其重组制品的多克隆抗体,ELISA、Western blot和免疫细胞化学等技术均检测到双岐杆菌胞壁组分可刺激肠上皮细胞高效表达HBD-2.P65免疫细胞化学染色检测到在双岐杆菌胞壁蛋白刺激下NF-κB向细胞核移位,IκB和磷酸化IκBwestern blot检测到IκB发生磷酸化和降解,表明基因转录因子NF-κB的活化,提示双岐杆菌胞壁蛋白信号可能通过NF-κB信号转导通路诱导肠上皮细胞β-防御素-2基因的表达.
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白念珠菌对角质形成细胞NF-κB核移位的影响
目的观察白念珠菌(简称白念)及其菌体成分对培养人角质形成细胞核因子кB(NF-κB)表达及核移位的影响,进一步揭示白念与角质形成细胞之间相互作用的机理.方法分别采用酶解、反复冻融、超声破碎和超速离心等方法制备白念菌体成分,白念、白念菌体成分和纯甘露聚糖分别与角质形成细胞共同培养1.5 h和3 h后,激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)检测细胞NF-кB的表达.结果正常培养的人角质形成细胞NF-κB主要表达于胞浆;白念、白念细胞壁提取物和纯甘露聚糖刺激细胞1.5h后NF-кB在细胞核表达明显增加,细胞浆明显减少(P＜0.01),3 h后又恢复到刺激前的状态;而白念培养上清液、细胞浆提取物刺激角质形成细胞后NF-κB表达无明显变化(P＞0.05).结论白念和甘露聚糖均可引起角质形成细胞NF-кB向细胞核内转移,进而活化该转录因子,调控靶基因的转录.甘露聚糖可能是白念引起NF-κB活化的重要活性成分之一.
关键词： 白念珠菌 角质形成细胞 核因子кB(NF-кB) 核移位
