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皮肤角质形成细胞的无血清培养方法
目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础.方法:无菌条件下,取2cm×2cm兔耳皮肤组织块,Dispase消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响.结果:在适当的Ca2+浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液k-SFM中培养扩增,多可传4～6代.添加血清后可明显加速细胞分化.结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建.
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银杏叶提取物对三氯乙烯诱导的人角质形成细胞凋亡的影响
目的 研究体外培养条件下银杏叶提取物(ginkgo biloba leaf extracts,EGb)对三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)诱导的正常人表皮角质形成细胞(normal human epidernis keratinocyte,NHEK)凋亡的影响.方法 体外培养条件下,用中性红吸附试验(NRU)测定TCE对NHEK的中性红吸附减少50%的质量浓度(NR50值)和EGb的低有效保护质量浓度.用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察细胞凋亡形态学改变,流式细胞仪(flow cytometer,FCM)测定细胞DNA含量并计算凋亡发生率.结果 TCE对NHEK的NR40值为4.53(3.92～5.13)mmol/L;用10、50、100、150和200 mg/L EGb预孵育NHEK 2 h时,由2.0 mmol/L TCE引起的细胞活力的下降随EGb剂量的增加逐渐恢复,且150 mg/L为低有效保护剂量.TCE可引起NHEK的超微结构呈凋亡改变,凋亡发生率呈剂量依赖式增加.与0.125、0.5和2.0 mmol/LTCE暴露组相比,150 mg/L EGb预孵育组,细胞超微结构恢复到正常对照组水平,凋亡发生率明显减少.结论 体外培养条件下,EGb可以抑制TCE诱导的NHEK的细胞凋亡.
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一氧化氮与角质形成细胞凋亡的研究进展
一氧化氮(NO)是一种自由基,也是一种具有重要生理和病理功能的信使分子.广泛分布于生物体内各种组织之中,在皮肤、心、脑、肝和免疫调节等病理和生理过程中有着十分重要的生物学作用.近年来的研究显示NO能双向调节角质形成细胞(KC)的凋亡,对许多皮肤疾病的发生发展产生重要影响,然而该调节机制目前尚未完全阐明,本文将综述NO对KC凋亡的双向调节机制研究进展以及一些与NO调节失调相关的皮肤疾病.
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当归多糖对表皮细胞促创面愈合的调控作用
目的:考察当归多糖通过对人表皮角质形成细胞(HKC)相关细胞因子和真皮成纤维细胞中胶原分泌的调控作用,研究当归在皮肤创面愈合中的作用.方法:采用含10%胎牛血清DMEM培养基,37℃,5% CO2细胞培养箱中培养人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞,加入当归多糖处理后,采用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性;免疫组化方法检测角质形成细胞分泌的转化生长因子-β(TGF-β)及白介素-1α(IL-1α)的表达情况,观测对成纤维细胞的增殖及Ⅲ型胶原分泌的作用.结果:当归多糖作用后,HKC促FC增殖作用增强;随着当归多糖浓度增高,HKC促增殖作用渐增强,在0.2 g·L(-1)时达高峰.当归多糖调控角质形成细胞TGF-β及IL-1α的分泌呈剂量依赖性,且能促进成纤维细胞增殖,增加胶原合成.结论:当归多糖通过对角质形成细胞TGF-β及IL-1α的表达具有显著的调节作用,影响真皮成纤维细胞Ⅲ型胶原的分泌,从而促进成纤维细胞增殖,提示角质形成细胞和真皮成纤维细胞参与了皮肤创面愈合过程,当归多糖可能在皮肤创面愈合中起重要作用.
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山茱萸水提取物对黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型黑素合成的影响
目的:考察山茱萸水提取物对体外构建的人黑素瘤细胞(A375)与角质形成细胞(Hacat)单层混合共培养模型黑素合成的影响.方法:将山茱萸水提取物制备成含生药0.75～12 g·L-1 5个质量浓度,细胞给药,通过MTT法、NaOH裂解法、多巴氧化法分别测定给药前后A375细胞与Hacat细胞共培养模型的细胞活力、黑素含量和酪氨酸酶活性.结果:与空白对照组相比,6,3,1.5,0.75 g·L-1山茱萸水提取物对共培养体系的细胞增殖率影响不大,对共培养体系黑素生成均有显著差异(P＜0.01),对共培养体系酪氨酸酶活性有差异(P＜0.05或P＜0.01);与阳性对照药物熊果苷相比,6,3 g·L-1山茱萸水提取物对共培养体系黑素生成有显著差异(P＜0.01),作用强于熊果苷,1.5,0.75 g·L-1山茱萸水提取物对共培养体系黑素生成无差异;与阳性对照药物熊果苷相比,6,3,1.5,0.75 g·L-1山茱萸水提取物对共培养体系酪氨酸酶活性无差异.结论:山茱萸水提取物能够通过抑制酪氨酸酶活性来抑制A375细胞和Hacat细胞共培养体系的黑索合成,为临床使用山茱萸治疗黄褐斑提供了实验依据.
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黄芩素对中波紫外线诱导角质形成细胞凋亡及相关细胞因子表达的影响
目的:研究黄芩素对中波紫外线(UVB)诱导角质形成细胞凋亡及相关细胞因子表达的影响.方法:体外培养人皮肤角质形成细胞(HaCaT),取对数生长期的细胞,随机分为空白组、模型组和黄芩素组,并用30 mJ·cm-2的UVB照射模型组和黄芩素组,建立光老化模型.噻唑蓝(MTT)比色法筛选黄芩素的有效安全浓度,并测定黄芩素对光老化HaCaT细胞增殖率的影响;活性氧自由基(ROS)试剂盒测定各组细胞中ROS含量;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定各组细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定各组细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),半胱氨酸天冬氨酸-3(Caspase-3)及Caspase-9蛋白表达水平.结果:筛选出1×10-,1×10-6,1×10-5mol·L-1黄芩素为佳有效安全浓度.与空白组比较,模型组ROS含量和细胞凋亡率显著升高(P＜0.01),BcL-2蛋白表达水平显著降低(P＜0.01),Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平显著升高(P＜0.01).与模型组比较,1×10-7,1 ×10-6,1 ×10-5mol·L-1黄芩素组ROS含量和细胞凋亡率显著降低(P ＜0.05,P＜0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P ＜0.05,P＜0.01),Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平显著下降(P ＜0.05,P＜0.01).结论:黄芩素可以通过降低细胞ROS含量和凋亡率,调控Bcl-2家族中抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达,降低凋亡相关细胞因子Caspase-3和Caspase-9的表达水平,抑制UVB诱导的细胞凋亡.
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甘草次酸对UVB诱导HaCaT细胞光老化的保护作用及相关细胞因子的影响
目的:研究甘草次酸对中波紫外线(UVB)诱导人皮肤角质形成细胞(HaCaT)细胞光老化的保护作用及相关炎症因子影响.方法:用不同浓度的甘草次酸作用于HaCaT细胞,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖率,筛选出药物佳有效浓度;用30 mJ·cm-2的UVB照射HaCaT细胞,建立光老化模型,用3个不同浓度的甘草次酸作用于光老化细胞,MTT比色法检测光老化HaCaT细胞增殖率;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),过氧化氢酶(CAT)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒分别检测甘草次酸对光老化HaCaT细胞中GSH-Px,CAT和LDH活性的影响;蛋白免疫印记法(Western blot)检测甘草次酸对光老化HaCaT细胞中白细胞介素-1β(IL-1β),IL-6和肿瘤坏死因子-a(TNF-α)蛋白表达量的影响.结果:筛选出1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol·L-1甘草次酸为佳有效浓度.与空白组比较,UVB组细胞增殖率显著降低(P＜0.01),GSH-Px,CAT活性显著降低,LDH活性显著升高(P＜0.01),IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表达量显著升高(P＜0.05,P＜0.01).与UVB组比较,1×10-7,1×10-6,1×10-5 mol·L-1甘草次酸+UVB组细胞增殖率显著上升(P＜0.01),GSH-Px,CAT活性显著上升,LDH活性显著降低(P＜0.01),IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表达量显著降低(P ＜0.05,P ＜0.01).结论:甘草次酸可通过提高GSH-Px,CAT活性,降低LDH活性,减少炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表达,从而抑制UVB诱导HaCaT细胞光老化.
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PSORI-CM01方抗银屑病的体内外药效考察
目的:观察PSORI-CM01方对银屑病模型动物的药效和对角质形成细胞HaCaT增殖抑制作用,考察其抗银屑病疗效.方法:将小鼠随机均分为正常组、模型组、阳性对照组(甲氨蝶呤片)、PSORI-CM01方低、中、高剂量组,口服给药,连续7d或14d,空白组和模型组给予等量纯净水,考察PSORI-CM01方对雌激素期小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂指数及小鼠尾部表皮鳞片中颗粒层鳞片数的影响;用MTT法检测不同浓度和时间PSORI-CM01方对HaCaT细胞增殖的抑制率.结果:PSORI-CM01方可显著抑制雌激素期小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂(P＜0.01),其中、高剂量组略优于阳性对照组;显著促进小鼠尾部鳞片表皮颗粒层的形成(P＜0.05,P＜0.01),其低、中剂量组与阳性对照组相当;细胞实验显示PSORI-CM01方对共同培养24、48、72h的HaCaT细胞均有一定抑制作用,24、48、72h的IC50分别为1.23、1.16、0.50g/L.结论:PSORI-CM01方可从多个方面改善银屑病表现,具有良好开发前景.
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中医药对银屑病T细胞相关免疫学作用机制的研究进展
银屑病是一种与免疫有关的慢性炎症性皮肤病,西医学从平衡“免疫网络”角度进行研究,中医学按照银屑病的不同证型辨证施治,二者有着极大的共通性.文章将从T辅助细胞(Th)细胞分化及相关细胞因子的表达入手,对中医药治疗银屑病中有关免疫功能异常的研究进展进行综述.
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黄连、土大黄、苍术提取液抗银屑病实验研究
目的 探讨中药黄连、土大黄、苍术提取液抗银屑病的作用机制.方法 采用体外细胞培养技术,选用人角质形成细胞株colo-16,观察黄连、土大黄、苍术单方及复方中药提取液对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激前后人角质形成细胞增殖的影响.结果 黄连、土大黄、苍术单方及复方中药提取液在TNF-α刺激前后均表现出显著的抑制人角质形成细胞增殖的作用,与对照组甲氨喋呤和环孢素A相比较,差异有显著性意义(P<0.01).结论 中药复方通过抑制人角质形成细胞的异常增殖对银屑病有治疗作用.
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不同纯度高良姜素对A375-HaCaT共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响
目的：研究不同纯度高良姜素对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞(A375-HaCaT)共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响。方法利用Transwell技术建立A375-HaCaT共培养体系,以0.1、0.5、1.0、5.0、10μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素作用于共培养模型。采用MTT比色法检测细胞增殖,NaOH裂解法测定黑素含量,多巴氧化法测定酪氨酸酶活性,ELISA法检测HaCaT细胞因子干细胞生长因子(SCF)、内皮素(ET)-1的表达。结果 A375-HaCaT共培养模型中的A375细胞生长良好,0.1、0.5、1.0、5.0、10μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素对共培养体系中的A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成均具有上调作用。各纯度高良姜素浓度≥0.5μg/mL时,能够提高HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平,且纯度70%的高良姜素作用强度优于90%的高良姜素。结论高良姜素能显著促进A375-HaCaT共培养模型中A375的细胞增殖及黑素合成,其作用机制可能与高良姜素上调HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平有关。
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愈银方含药血清对角质形成细胞增殖与凋亡的影响
目的:探讨愈银方对角质形成细胞株C0LO-16增殖及凋亡的调节作用.方法:利用体外细胞培养技术、MTT法、流式细胞仪、荧光显微镜技术检测愈银方的大鼠含药血清对COLO-16细胞株增殖及凋亡的影响.结果:愈银方含药血清对C0L0-16细胞株增殖的抑制作用与浓度呈一定的关系,浓度越高则抑制作用越强.含药血清的浓度为10%、20%;设相应的正常大鼠血清浓度为对照组,培养48h后,C0L0-16细胞的凋亡率分别为12.93%、19.80%,正常对照组为3.71%、10.96%,两者相比差异显著.结论:抑制C0L0-16细胞株的增殖及诱导其凋亡可能是愈银方治疗银屑病的机理之一.
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EGF对HaCaT细胞中神经元限制性沉默因子表达的影响
表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)在皮肤的发育、稳态维系和创伤修复中起重要作用.EGF能够通过与受体结合激活下游信号通路,促进角质形成细胞的增殖,此过程中涉及多种转录调控因子的参与,其中包括Kruppel转录因子家族的神经元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencing factor,REST/NRSF),REST能够与NRSE/RE1(neuron-restrictive silencer element,NRSE;又称repressor element 1,REl)等序列结合,使组蛋白去乙酰化,阻遏基因转录[1].本文研究了EGF对皮肤角质形成细胞HaCaT细胞系中REST表达的影响,为探索REST在角质形成细胞中的调控机制提供依据.
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人2型糖尿病皮肤角质形成细胞的无血清培养及纯化
目的 体外原代无血清培养人2型糖尿病皮肤角质形成细胞,并进行纯化.方法 采用中性蛋白酶-胰蛋白酶两步消化法分离人2型糖尿病皮肤角质形成细胞,使用无血清培养基进行原代培养,通过两步消化传代纯化细胞,使用倒置相差显微镜观察细胞生长状态,WST-8法测定细胞增殖曲线,流式细胞术检测其表型和纯度.结果 无血清培养并纯化的角质形成细胞呈典型的上皮形态,第3代角质形成细胞增殖曲线为S形,对数增长期的平均倍增时间为36.9 h,角蛋白阳性率为98.9％.结论 建立高纯度的人2型糖尿病皮肤角质形成细胞的无血清培养方法.
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P38丝裂原活化蛋白激酶在紫外线诱导角质形成细胞凋亡中的作用
目的 探讨中波紫外线(UVB)诱导角质形成细胞凋亡机制.方法 使用0、20、30、40、60、70、90 mJ/cm2 UVB辐射人角质形成细胞(HaCaT),辐射后0、1、2、3、4、6、24、48 h收集细胞和上清.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;ELISA检测上清液中TNF-α水平;Western blot检测P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38MAPK)的表达.结果 UVB(30 mJ/cm2)辐射后,HaCaT细胞分泌TNF-α逐渐增加,24 h达高峰;P38抑制剂SB203580完全抑制TNF-α的分泌,部分阻止了细胞凋亡;以不同剂量UVB辐射HacaT细胞,在30 mJ/cm2时p-P38 MAPK表达量高,且辐射后即可检测到p-P38 MAPK的表达,1 h时达高峰,以后逐渐下降,而P38MAPK表达量没有明显变化.结论 紫外线可通过激活P38 MAPK途经,促进TNF-α分泌来诱导角质形成细胞凋亡.
关键词： 角质形成细胞 中波紫外线 凋亡 p38丝裂原活化蛋白激酶 -
肿瘤坏死因子α对银屑病患者角质形成细胞白介素8产生的影响
肿瘤坏死因子α(TNF-α)作为一种免疫和炎症反应介质,参与炎症性皮肤病的发病.白介素8(IL-8)是诱导银屑病患者皮肤局部炎细胞浸润及皮损形成的重要炎性因子.为揭示TNF-α与IL-8间的关系及其在触发银屑病皮损炎症反应中的作用,我们对不同浓度TNF-α对角质形成细胞(KC)IL-8产生的影响进行了研究.
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HPV L2多肽疫苗的作用机制及其研究进展
早在20世纪70年代,人们就发现人乳头瘤病毒(HPV)感染可以引起人体不同部位的疣状病变,进一步的研究发现,HPV可以通过微小损伤侵入机体表皮和黏膜上皮,潜伏于上皮基底细胞,时机成熟进入角质形成细胞进行增殖,引起皮肤乳头瘤样损害.根据HPV致癌性的不同,可将其分为低危型和高危型.其中,高危型HPV感染与食管癌、喉癌、舌癌等恶性肿瘤的发生有关,尤其是与宫颈癌发生的关系尤为密切[1].
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血卟啉单甲醚光动力学疗法对体外培养的人角质形成细胞增生的影响
目的观察人角质形成细胞株Hacat对血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)的吸收特性及HMME-PDT对角质形成细胞增生的影响.方法对数生长期的Hacat细胞分别与浓度为0、10、20和40 μg/ml的HMME孵育1 h;同时将另一实验组的Hacat细胞与10μg/ml的HMME分别孵育0和30 min、1和2 h,分别以流式细胞仪检测孵育时间和孵育浓度对Hacat细胞吸收HMME的影响;在此基础上,将Hacat细胞分别与0、2.5、5、10、20和40 μg/ml的HMME孵育2 h,用532 nm的倍频Nd:YAG激光以20 mW/cm2的功率密度分别照射0、2.5、5、10、20 min,同时设立完全空白对照组和单纯光敏剂组,24 h后以MTT法检测Hacat细胞的存活率.结果Hacat细胞对HMME吸收量随着孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增多.单独照光或以高达40 μg/ml的HMME孵育对Hacat无明显杀伤(P＞0.05).在激光功率密度相同的情况下,HMME-PDT对Hacat细胞的杀伤呈孵育浓度和激光能量密度相关性.结论Hacat细胞对HMME吸收呈孵育浓度和孵育时间相关性,孵育浓度及激光能量密度是影响HMME-PDT杀伤效应非常重要的影响因素,在实验范围内的HMME-PDT能对Hacat细胞产生明显的杀伤作用.
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光动力处理的角质形成细胞衍生的细胞因子旁分泌诱导成纤维细胞内基质金属蛋白酶的合成
研究背景和目的新近的研究发现,5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid,ALA)介导的光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)能够直接影响成纤维细胞所生成具有胶原降解作用的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1和MMP-3的水平,并认为这与ALA-PDT治疗局限性硬皮病的抗硬化效应有关.
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血浆置换治疗3例寻常型天疱疮的治疗体会
天疱疮(Pemphigus)是一种慢性自身免疫性皮肤病,描述一组慢性大疱性皮肤病,抗体直接作用于角质形成细胞的表面,通过棘层松解这一过程,造成角质形成细胞间黏附丧失[1].被分为3个主要类型:寻常型天疱疮、落叶型天疱疮和副肿瘤型天疱疮.常采用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗.随着对该病认识,部分药物治疗效果欠佳的患者采用双膜血浆置换疗法(Double Filtration Plasmapheresis,DFPP)取得一定的效果.北京协和医院血液净化中心应用双膜血浆置换疗法治疗寻常型天疱疮3例,现将治疗体会总结如下.
