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寒丰黑穗醋栗的修剪技术
寒丰是黑龙江省农科院牡丹江农科所采用远缘杂交方法选育的黑穗醋栗新品种,其母本为品质好、丰产性强的亮叶厚皮,父本为抗寒、大果型、高营养的野生兴安茶蔗。寒丰具有很强的抗寒性,在黑龙江、吉林、内蒙古高寒地区无需任何防寒措施可安全越冬,深受果农的欢迎。
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RT-PCR酶联杂交法定量测定人PBMC中的IL-1βmRNA
IL-1β是由淋巴细胞和非淋巴细胞分泌的一种细胞因子,除参与免疫调控、神经内分泌及抗肿瘤等多种生理过程外,并与发热、炎症以及某些疾病的病理变化有关,因而在临床及科研中,很多情况下需要了解IL-1β mRNA的表达水平[1].目前,主要采用点杂交、RT-PCR标准曲线法及实时荧光PCR等对IL-1β mRNA进行定量.这些方法,仍存在着某些不足,本研究利用特制的DNA结合板,设计了一种酶联夹心杂交方法,能简便、准确地对RT-PCR扩增后的人外周血单个核细胞(PBMC)中的IL-1β mRNA进行定量.
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耐热碱性磷酸酶在细菌染色体定量杂交方法中的应用
定量DNA杂交是细菌遗传学分类的重要方法,其结果受到杂交温度和对杂交体进行检测时环境温度的影响.本研究利用耐热碱性磷酸酶取代传统的不耐热酶于微量板定量杂交试验,获得了较为满意的结果.
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基质金属蛋白酶在非酒精性脂肪性肝炎患者肝组织中的表达
目的:探讨MMP-1,NMP-2,MT1-MMP和MT2-MMP在NASH肝纤维化中的相互作用及可能机制.方法:采用原位分子杂交方法检测40例NASH患者的肝穿刺标本中MMP-1,MMP-2,MT1-MMP和MT 2-MMPmRNA的表达.结果:MMP-1,MMP-2,MT1-MMP和MT 2-MMPmRNA主要表达在纤维间隔和汇管区的间质细胞(肝星状细胞等),且MMP-2和MT1-MMP的表达细胞有重叠.NASH组MMP-2,MT1-MMP,MT 2-MMP mRNA的表达均低于ASH组(P=0.03,P=0.007,P=0.001)结论:MMP-1,MMP-2,MT1-MMP和MT 2-MMP在NASH肝纤维化的发生和发展中可能起重要作用;MMP-2和MT1-MMP在基质降解过程中可能有协同作用;肝星状细胞为肝组织内MMP-1,MMp-2,MT1-MMP和MT2-MMP的主要产生细胞.
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截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究
目的:应用抑制性消减杂交方法构建截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式调节基因的消减文库,用免疫印迹方法验证截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白对c-myc基因的上调表达.方法:构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt,分别以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-Mt和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,用抑制性消减杂交技术,将实验组与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),构建eDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.生物信息学分析结果显示部分与肿瘤发生密切相关的基因,如癌基因c-myc.结果:显示截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白可以反式激活c-myc基因,并上调其表达.结论:成功构建截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的消减文库,细胞原癌基因c-myc是MHBst反式激活作用的靶基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础.
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大鼠肝癌形成过程中癌基因表达变化的意义
目的:探讨癌基因在实验性大鼠肝癌形成过程中的表达变化特点及其生物学意义.方法:应用化学致癌剂3'-Me-DAB建立大鼠肝癌模型,取其肝脏用核酸原位杂交和RNA Slot blot杂交方法,动态检测c-myc、Ha-ras和Ki-ras在实验性大鼠肝癌形成过程中的表达变化.结果:在诱癌全过程中,c-myc和Ha-ras均为同步表达;在诱癌的早期可检测到较多c-myc和Ha-fas的阳性表达细胞,而Ki-ras阳性的细胞数则很少,且反应强度弱;而诱癌后期,各癌基因mRNA阳性表达细胞均减少;至17 wk,所有癌组织内均显示3种癌基因表达阴性,或仅见个别小癌巢内少数癌细胞呈弱阳性.而癌旁肝组织内却可见三种癌基因的大量表达.结论:c-myc与Ha-fas被激活是肝癌发生过程中的早期事件,且二者之间具有协同作用,而这种协同作用在肝癌的启动上可能具有重要意义;Ki-ras的激活则发生较晚,可能与促进细胞恶性转化有关.
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蛋白质免疫印迹(Western Blot)
该技术可以从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。原理:Western免疫印迹( Western Blot )是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
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基因表达谱芯片筛选瘢痕疙瘩差异表达基因
目的:瘢痕疙瘩是皮肤真皮伤愈合后遗留的高出周围皮肤、发红、坚硬的病理结构.患者不仅有瘙痒、刺痛等症状,关节部位瘢痕挛缩常限制肢体的功能活动,在面部等暴露部位还可导致毁容,从而严重影响患者的身心健康和受损部位的功能恢复,成为影响严重烧、创伤病人康复的一大难题.从分子水平了解瘢痕疙瘩发生机制,将为治疗这一病症提供可靠的线索,因此本课题探讨与瘢痕疙瘩发生相关基因群的表达变化,并对部分基因的功能进行初步分析.方法:按一步法抽提瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的总RNA并纯化mRNA将8464条人类基因PCR产物按微阵矩排列点样于化学涂层的载玻片上,制成基因芯片.将等量的瘢痕疙瘩和正常皮肤的mRNA分别逆转录合成荧光分子(Cy5或Cy3)掺入的cDNA一链做探针,混合后与上述基因芯片杂交.经严格洗片后扫描芯片荧光信号图像,计算机分析后比较两种组织中差异表达的基因.通过RT-PCR技术和Northern杂交检测TGF-β1和c-myc基因在不同组织中的表达变化.结果:在8464种基因中,瘢痕疙瘩和患者自身正常皮肤组织间存在差异表达基因,在所测的3对临床标本中共有差异表达基因436条.根据这些基因表达蛋白的结构和功能,可以分为15类,如:癌基因和抑癌基因,运输蛋白基因,细胞信号和传导蛋白基因,细胞应急蛋白基因,与细胞骨架和运动相关的蛋白基因,细胞凋亡蛋白基因等,其中上调基因有282条(3.33%),包括TGFβ1和c-myc基因;下调基因有154条(1.82%).RT-PCR和Northern杂交方法证实,瘢痕疙瘩内TGFβ1和c-myc的mRNA含量都明显高于正常皮肤.结论:瘢痕疙瘩的发生是一个复杂的过程,多种基因表达的变化与其形成相关.微阵矩基因芯片在筛选瘢痕发生相关基因的改变时,具有快速、高通量和高敏感等特点,瘢痕疙瘩差异表达谱的分析为治疗瘢痕提供了新的思路和线索.
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缺氧诱导因子-1αmRNA表达与胃癌血管生成、侵袭转移及预后的关系
近年来发现的转录因子缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在氧平衡及肿瘤微血管形成中起着重要作用,HIF-1由α和β两个亚单位组成.其中HIF-1α是决定HIF-1活性的缺氧调节亚基.为此,我们采用原位分子杂交方法检测胃癌组织中的HIF-1α mRNA表达并分析其与血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白,微血管密度(MVD)及生存期的关系,旨在探讨HIF-1α和VEGF在胃癌侵袭转移中的作用及对胃癌患者预后的影响.
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肿瘤抑制基因survivin的研究进展
survivin是存活蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员.1997年由Ambrosini等[1]应用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell proteasa receptor-1,EPR-1)的cDNA通过杂交方法在人类基因组文库中筛选并鉴定出来.survivin广泛表达于人的胚胎组织和几乎所有人类常见恶性肿瘤组织,而在正常成人组织和终末分化的组织内检测不到.
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SAM鼠脑细胞端粒与端粒酶的增龄性变化及针刺的影响
本研究采用快速老化模型小白鼠SAM_P10为脑老化动物模型,以与其同源的正常老化鼠SAM_R1为对照,采用分子杂交方法测定细胞端粒长度;采用PCR_ELISA法测定端粒酶活性,研究其脑细胞端粒的长度及随增龄的变化;并研究针刺是否对脑细胞端粒或启动端粒酶基因有影响,以揭示SAM小鼠脑老化与端粒的关系,并探讨针刺抑制脑细胞凋亡及抗衰老的作用机制.结果如下.
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利用改良抑制消减杂交方法建立再生障碍性贫血CD4+T细胞的基因差异表达文库
目前发现T细胞介导的免疫在再生障碍性贫血(再障)发病机制中起重要作用,并且已有多个独立的研究小组从再障患者外周血及骨髓中成功分离出能引起造血功能衰竭的致病相关性T细胞克隆,并证实其表型为CD4+T细胞[1,2],但这些T细胞异常增殖、活化及抑制机体造血功能的具体机制仍不清楚.我们通过改良抑制消减杂交的方法,建立CD4+T细胞的差异基因表达文库,为揭示再障病理损伤的机制提供线索.
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逆向斑点分子杂交——一种同时检测HBV DNA及HBV DNA聚合酶的新方法
自1983年以来,以直接点样的、简化的斑点分子杂交方法检测乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)DNA,已广泛在临床应用[1~6].HBVDNA检测的重要性也已被确认,成为判断乙肝病毒带毒者感染状态及垂直传播免疫阻断的重要标志之一.然而,HBV DNA聚合酶的测定,尚有待改进.理论上讲,只有同时检出HBVDNA和DNA聚合酶的共存,才是确证HBV感染病毒存在可靠的证据.作者曾报道一种同时检测ⅡBV DNA及聚合酶的方法(7),但由于需要凝胶电泳等较繁复的步骤,在临床广泛应用上尚有困难.本文报道一种新的逆向斑点分子杂交方法,不仅简化了步骤,而且适合于临床应用,将为判定HBV带毒者的感染状态及防治监测提供重要手段.
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不明原因持续肝功能异常患者肝组织和外周血单核细胞中乙型肝炎病毒DNA检测分析
近年来随着原位分子杂交方法的建立,使我们能够直观地检测到细胞和组织中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA颗粒及其定位分布情况.
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比较基因组杂交方法在头颈部鳞癌研究中的应用
摘要比较基因组杂交(CGH)是一种将消减杂交和荧光原位杂交(FISH)相结合的分子细胞遗传学技术,可在全部染色体区带上检测基因组间DNA拷贝数增减变化并定位.本文综述了CGH检测头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的研究结果及其应用.
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温州市2994例妇女人乳头瘤病毒感染情况分析
近年来宫颈癌发病率有上升且年轻化的趋势[1,2].由于宫颈癌存在着一个较长的、可逆转的癌前病变期,早期宫颈癌患者治愈率高达90%,宫颈癌及癌前病变的早期筛查与处理是防治宫颈癌的主要手段.为了解本地区妇女生殖道人乳头瘤病毒(human papillo-mavirus,HPV)感染及型别、年龄分布情况,本文采用凯普导流杂交方法对温州地区妇女宫颈HPV感染情况进行检测分析,现报道如下.
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32株孢子丝菌临床株两种基因分型方法比较
我们曾应用随机扩增多态DNA(RAPD)技术和rDNA限制性片段长度多态性(RFLP)-Southern印迹杂交方法进行申克孢子丝菌种内分型[1-2],国内外众多学者亦将线粒体DNA限制性片段长度多态性(mtDNA RFLP)方法用于孢子丝菌种内分型的研究中[3-6].
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Survivin与肿瘤
survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员.1997年,由耶鲁大学的Altieri等[1]应用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell proteasa receptor-1,EPR-1)的cDNA通过杂交方法在人类基因组文库中筛选并鉴定出来.survivin广泛表达于人的胚胎组织和几乎所有人类常见恶性肿瘤组织,而在正常成人组织和终末分化的组织内检测不到.本文就survivin的生物学特性及其与肿瘤的关系作一综述.
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聚合酶链反应-反向点杂交方法检测肿瘤坏死因子-α基因启动子区308A/G多态性
随着基因组计划的完成,单核苷酸多态性(SNPs)作为基因组中普遍的序列差异已成为研究的热点,在易感人群的筛选、疾病的预防及将来的基因治疗研究中发挥重要作用[1].
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FISH产前诊断一例特殊易位型先天愚型儿
患者女,36岁,结婚10年。第1胎生一先天愚型儿,核型为46,XY,-13,t(21;13)(21pter→21cen→21q22∷13q11→13qter)。因第2次怀孕,妊娠19+1周,要求产前检查就诊。在B超定位下,常规消毒,抽取羊水15 ml,12 ml羊水培养,3 ml做FISH。FISH采用不培养的羊水细胞。探针选用美国VYSIS公司提供的21号染色体特异性探针,荧光染色为桔红色(LSI21 Spectrum orange)。羊水细胞制片及杂交方法按VYSIS提供。杂交结果于24~48 h后用NIKONE-1000型荧光显微镜观察,AI图像分析仪分析结果,激发光滤片使用E×450-490。共统计200个羊水细胞,杂交率为85%,在杂交的羊水细胞中,有3个桔红色杂交信号者占88%,两个杂交信号者占12%,且多数为其中一个杂交信号较大,可能是两个信号重叠在一起。诊断为先天愚型。在FISH检查出结果后15天,羊水培养结果显示胎儿核型为46,XY,-13,t(21;13)(21pter→21cen→21q22∷13q11→13qter)。孕妇即在当地引产,胎儿呈典型先天愚型儿貌。