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微波快速原位杂交技术检测基因表达
核酸原位杂交技术目前已广泛应用于组织及细胞的基因表达定位和定量分析以及病毒基因组及表达的检测。常规的原位杂交技术主要强调组织细胞切片的前处理以提高其渗透性。常用的方法为蛋白酶酶解处理，但其作用的浓度和时间具有很大的范围，常难以准确把握。另外，杂交常需要16～24 h，检测周期长。近来，为了以稳定的、易控制的方法取代蛋白酶处理和缩短杂交的时间，我们应用微波处理技术，对以上两个步骤进行改良取得了很好的效果。
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抗原修复技术研究发展的新起点
7年多前，我们曾经受贵刊编辑部之邀发表过“抗原修复技术研究进展”一文［1］。在那篇文章里，尽管已经有片言只语提到可以应用抗原修复技术原则从石蜡切片中提取蛋白质和核酸。但是，全文的主题与绝大部分内容还是局限在免疫组织化学染色的问题方面。转瞬过去的7年在后基因组时代的舞台上大放异彩，高通量检测数以千计的蛋白质组学分析技术的开发以及各种形形色色的蛋白质质谱分析技术的开发，在探讨人类疾病的多种相关生物标志物及其在诊断治疗上，正在扮演着先锋作用的重要角色［2-4］。图像质谱分析是近开发出来的一门新技术，它是建立在质谱分析法特别是通过基质辅助激光解析（ matrix-assisted laser desorption ionization ）技术或者次级离子质谱分析法（ secondary ion mass spectrometry ）能够在一张组织切片上进行蛋白质、脂质等细胞组成成分在组织结构内的质谱分析。1997年，离子质谱分析法（ IMS ）早由Caprioli的实验室发表。此后不久即开始用于临床研究，如癌组织中HER2表达以及分布等的研究显示出颇具魅力的发展前景。但是，这些新兴的技术从开始起步就面临着和20多年前免疫组织化学在常规甲醛固定石蜡包埋（ FFPE ）组织切片染色上同样的尴尬局面：必须依赖新鲜组织冷冻切片。随着抗原修复技术在石蜡切片免疫组织化学染色的广泛推广，人们从数以万计的近代有关加热抗原修复技术的文章中，毫不怀疑地认识到，加热抗原修复技术在免疫组织化学染色等方面取得的优异成果，开启了如何把现代分子生物学技术用于FFPE组织科研宝库的途径。继免疫组织化学染色之后，加热抗原修复技术的基本原理已经成功地被用于包埋前、后免疫电镜染色，核酸原位杂交，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记，从石蜡包埋组织中提取蛋白质或核酸等一系列的重要成绩。2008至2011年期间，意大利的Ronci等［5］、澳大利亚的Gustafsson等［6］、美国的Casadonte和Caprioli［7］相继发表了他们经过反复试验、成功地采用加热抗原修复技术方法，使得IMS能够用于常规FFPE组织切片的文章，由于从事IMS技术开发的科学家们逐渐从与日俱增的加热抗原修复在免疫组织化学染色等方面令人瞩目的成绩中，认识到FFPE人体组织是不可取代的极为宝贵的科学研究资源，任何一种现代化的分子生物学技术都不能够仅仅局限于新鲜组织冷冻切片。必须千方百计地寻求一种能够克服FFPE处理给予组织内高分子成分带来的负面影响的有效方法。于是，一切从事与常规FFPE组织标本相关联的科学研究和技术开发都顺理成章地归结到加热抗原修复技术。有力地证明这一极为简单的加热修复方法的确提供了解放石蜡组织中的蛋白质等高分子结构成分的坦途，开启了为病理学家和形态学家步入分子病理学、形态学的大门。
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内皮型一氧化氮合成酶及其mRNA在慢性乙型肝炎肝组织中的表达及意义
目的研究内皮型一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及其mRNA在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)肝组织中的表达及与肝组织病变的关系和临床意义.方法采用免疫组化及核酸原位杂交等技术对48例CHB肝组织中eNOS的表达进行了观察和分析,同时研究了eNOS对CHB肝组织中转化生长因子-β受体Ⅰ(Transforming growth factor-β receptor Ⅰ,TGF-β RⅠ)的表达的影响.结果 eNOS主要表达于肝细胞、窦内皮细胞及血管内皮细胞,以肝细胞为主.连续切片观察,eNOS mRNA的表达与其酶蛋白的表达在阳性细胞数量及分布上基本一致.随CHB肝组织炎症程度和纤维化程度的加重,eNOS表达增强(r=0.6855,P<0.05;r=0.4828,P<0.05).随eNOS表达上调,患者PA及血清ALB下降(F=3.4101,P<0.05;F=9.1714,P<0.01).CHB肝组织内eNOS的表达与TGF-β RⅠ的表达呈明显正相关(r=0.7781,P<0.05).结论 eNOS可能通过影响TGF-β RⅠ在肝组织中的表达,参与CHB肝组织病理损伤过程.
关键词： 内皮型一氧化氮合成酶 转化生长因子-β受体Ⅰ 慢性肝炎 病毒性 免疫组织化学 核酸原位杂交 -
大鼠肝癌形成过程中癌基因表达变化的意义
目的:探讨癌基因在实验性大鼠肝癌形成过程中的表达变化特点及其生物学意义.方法:应用化学致癌剂3'-Me-DAB建立大鼠肝癌模型,取其肝脏用核酸原位杂交和RNA Slot blot杂交方法,动态检测c-myc、Ha-ras和Ki-ras在实验性大鼠肝癌形成过程中的表达变化.结果:在诱癌全过程中,c-myc和Ha-ras均为同步表达;在诱癌的早期可检测到较多c-myc和Ha-fas的阳性表达细胞,而Ki-ras阳性的细胞数则很少,且反应强度弱;而诱癌后期,各癌基因mRNA阳性表达细胞均减少;至17 wk,所有癌组织内均显示3种癌基因表达阴性,或仅见个别小癌巢内少数癌细胞呈弱阳性.而癌旁肝组织内却可见三种癌基因的大量表达.结论:c-myc与Ha-fas被激活是肝癌发生过程中的早期事件,且二者之间具有协同作用,而这种协同作用在肝癌的启动上可能具有重要意义;Ki-ras的激活则发生较晚,可能与促进细胞恶性转化有关.
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HIV/AIDS病人肝脏HIV-1 RNA和p24抗原的检测
目的 了解艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)在肝组织的表达和分布情况,探讨HIV/艾滋病(AIDS)病人发生肝损害的可能机制.方法 先后采用免疫组织化学方法和核酸原位杂交方法,检测HIV/AIDS病人肝组织病理切片中的HIV-p24抗原和HIV-1核酸.结果 14例HIV/AIDS病人肝切片组织的Kupffer细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞和肝细胞,均检测到HIV-p24抗原.所有切片组织的Kupffer细胞、淋巴细胞有HIV RNA阳性表达,其中4例标本的肝细胞浆内有HIV RNA表达.结论 HIV-1可能在肝脏实质细胞和间质细胞内复制表达,并引起肝脏损害.
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多个生物素标记的SARS冠状病毒cDNA探针在原位杂交中的应用
严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)是一种由新型(种)冠状病毒引起的传染性疾病,利用核酸原位杂交技术方法研究组织内SARS冠状病毒感染的细胞种类、分布及病毒载量是SARS病理学和在体病原学研究的重要课题.
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p16和bcl-2基因与结核分枝杆菌L型感染在前列腺癌中的表达及意义
目的探讨p16抑癌基因和bcl-2凋亡抑制基因及结核分枝杆菌L型感染与前列腺癌的生物学行为.方法采用抗酸染色、免疫组化和核酸原位杂交等方法检测了58例前列腺癌患者中的结核分枝杆菌L型的检出率及p16和bcl-2基因的表达.结果 58例前列腺癌中结核分枝杆菌L型检出率为37.9%(22/58),结核分枝杆菌抗原阳性表达为39.7%(23/58);p16蛋白表达阳性率51.7%(30/58),失表达率48.3%(28/58),其中Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级的p16蛋白失表达率各为21.1%、56.3%、85.7%(P＜0.05),p16mRNA失表达率分别为20%、40%、80%(P＜0.05),而bcl-2蛋白表达阳性率60.3%(35/58),Ⅰ级、Ⅱ及、Ⅲ及分别为31.6%、68.8%、100%,bcl-2 mRNA阳性表达率各为20%、60%、100%(P＜0.05).结论细菌L型感染可能和bcl-2、p16基因协同在前列腺癌发生和发展中起重要作用.p16基因的缺失、突变和高甲基化,bcl-2基因的异常表达在前列腺癌的发生和发展中起重要的作用.
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哮喘肺组织和外周血淋巴细胞端粒酶逆转录酶表达上调及其意义
目的:研究支气管哮喘(哮喘)肺组织和哮喘病人外周血淋巴细胞端粒酶逆转录酶(TERT)mRNA和蛋白质的表达,并探讨其在哮喘发病机制中的作用及其临床意义.方法:用核酸原位杂交和免疫组织化学方法检测了6只豚鼠哮喘模型组织、6只正常对照组肺组织、16例哮喘发作期和14例正常人外周血淋巴细胞TERTmRNA和蛋白质的表达.结果:哮喘豚鼠肺组织中气道上皮细胞和淋巴小结,以及哮喘病人外周血淋巴细胞TERT mRNA和蛋白质表达强度显著高于正常对照组,哮喘病人外周血淋巴细胞TERT mRNA和蛋白质表达的阳性指数与哮喘病人FEV1/预计值、MVV/预计值比值呈显著负相关,与血清IgE水平呈显著正相关.结论:(1)TERT在哮喘豚鼠气道上皮、肺淋巴小结和人体外周血淋巴细胞中表达上调;(2)检测人体外周血液中淋巴细胞TERT表达强度有望可以作为衡量哮喘病情的指标.
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脑胶质瘤中PDGF-B、PDGFR-β、PTEN和p16基因的表达
目的探讨PDGF-B、PDGFR-β与抑癌基因PTEN、p16在脑胶质瘤发生和进展中的作用.方法应用核酸原位杂交方法检测125例胶质瘤切片中PDGFK-B、PDGFR-β、PTEN和p16 mRNA表达情况.结果胶质瘤PDGF-B、PDGFR-β阳性表达率分别为47.20%和 49.60%,并随着肿瘤级别升高而表达增加(P<0.05).PTEN、p16 mRNA阳性表达率 34.96%和45.53%.高级别胶质瘤中PTEN、p16 mRNA表达率分别为27.72%和38.61%,低于低级别胶质瘤(68.18%和77.27%,P<0.01).结论 PDGF-B、PDGFR-β mRNA高表达和PTEN、p16 mRNA失表达与胶质瘤进展有关.
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泡球蚴感染过程中宿主CD+4细胞凋亡和凋亡相关基因转录水平的研究
目的为了探讨泡球蚴感染宿主CD+4淋巴细胞缺失的机制,以及泡球蚴感染与宿主CD+4淋巴细胞凋亡及凋亡相关基因转录水平的相关性.方法利用尼龙柱和补体法从泡球蚴感染12周,25周和正常对照组BALB/c小鼠脾脏分离出纯CD+4,CD+8细胞,在体外分别经EmAg,anti-CD3,IL-2,TNFα,PWM刺激培养16h;Tunel和PI双染后,FCM分析凋亡细胞数;并用C-myc,TGF-β,bcl-2 cDNA探针检测感染25周EmAg诱导CD+4细胞的凋亡相关基因转录水平.结果 FCM分析,感染12周组CD+4,CD+8细胞凋亡数同正常对照组无明显差别(P＞0.05),感染25周组CD+4细胞凋亡数较正常对照组显著增高(P＜0.01),也显著性高于同组CD+8细胞(P＜0.01).CD+4细胞内C-myc,TGF-β mRNA水平较正常对照组显著升高(P＜0.05),而bcl-2 mRNA水平则减弱(P＜0.05).结论泡球蚴寄生宿主后期,可诱导宿主成熟T细胞中CD+4细胞发生凋亡,使宿主处于免疫抑制状态.凋亡的形成与凋亡信号增加,抑制信号减弱所引起.
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原位杂交检测子宫内膜癌中金黄色葡萄球菌L型DNA
目的研究细菌L型感染与子宫内膜腺癌的相关性.方法用革兰染色、免疫组化和DNA核酸探针原位杂交等方法,对66例子宫内膜腺癌,30例子宫内膜增生症进行检测.结果子宫内膜腺癌和内膜增生症中革兰氏染色细菌L型阳性率分别为54.5%,56.7%;免疫组化染色(S-P法)检测阳性率分别为56.1%和60.6%;20例子宫内膜腺癌标本,用金黄色葡萄球菌(金葡菌)L型地高辛标记的核酸探针作原位杂交,结果发现45%的宫内膜腺上皮细胞核内显示有金葡菌L型DNA阳性颗粒.结论提示细菌及其L型可侵入子宫内膜腺上皮细胞,导致细胞异常增生甚至肿瘤发生.证明子宫内膜腺癌的发生与细菌L型感染有一定的相关性.
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核酸原位杂交和聚合酶链反应法检测78例尖锐湿疣HPV DNA分析
尖锐湿疣(CA)是由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的性传播疾病.为从分子水平上诊断和鉴别诊断尖锐湿疣,我们应用HPV6/11 DNA探针核酸原位杂交和聚合酶链反应(PCB)法对尖锐湿疣组织中HPV进行了检测,报道如下.
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HAB18G在肝癌细胞中免疫组化和原位杂交的研究
抗人肝癌单抗HAB18早已证实与肝癌组织有很好的亲和力,以其为载体的导向药物治疗肝癌目前已进入临床实验.为了更好的了解其相应抗原在肝癌表达的意义,我们对四种肝癌细胞与正常肝细胞HAB18GmRNA及相应蛋白的表达进行了细胞内定位及半定量分析,试图探索HAB18G基因蛋白产物的表达规律.
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端粒酶逆转录酶mRNA和蛋白质在正常肺组织和正常人外周血淋巴细胞表达的研究
用核酸原位杂交和用免疫组织化学法检测了6例豚鼠正常肺组织、10～18例癌旁正常肺组织和14例正常人外周血端粒酶逆转录酶(TERT) 亚基的mRNA和相应蛋白质表达.结果显示,豚鼠和人体正常肺组织支气管上皮细胞,肺泡巨噬细胞和少数肺泡上皮细胞有TERT mRNA和蛋白质表达.正常人外周血淋巴细胞中TERT原位杂交阳性表达细胞数为(17.26±8.57)%,免疫组织化学阳性细胞表达数为(28.10±16.78)%.提示:①正常肺组织支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、少数肺泡上皮细胞和外周血淋巴细胞有TERT mRNA和蛋白质表达;②正常肺组织中上述细胞TERT mRNA和蛋白质的表达在生理状况下对于保证支气管上皮和肺泡上皮细胞再生,维持上皮组织的完整性可能起着重要的作用,同时有利于肺泡巨噬细胞发挥其肺内"卫士”功能;③淋巴细胞TERT表达对于维持机体的免疫功能可能有重要作用.
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女性外阴尖锐湿疣与假性湿疣的临床与病理诊断分析
目的:探讨女性外阴尖锐湿疣与假性湿疣的临床与病理鉴别方法,为临床诊治提供依据.方法:回顾性分析2007年2月-2009年4月我院门诊诊断或疑似为尖锐湿疣及假性湿疣的患者230例,观察并对比尖锐湿疣与假性湿疣的临床及病理组织学特点,并辅以HPV免疫组化及核酸原位杂交检测;收集230例尖锐湿疣及假性湿疣石蜡包埋组织标本,用HPV克隆抗体行免疫组化染色,用HPV6/11DNA的寡核苷酸探针行原位杂交.结果:尖锐湿疣与假性湿疣的上皮均呈乳头状结构,但尖锐湿疣有明显的基底细胞增生、上皮增厚,具有典型的挖空细胞,假性湿疣则无相应改变.191例HPV免疫组化染色,尖锐湿疣HPV-Ag阳性99例(占51.83%),HPV6/11DNA阳性182例(占95.28%),差异有显著意义(P<0.01).39例假性湿疣HPV-Ag-HPV6/11均为阴性.结论:假性湿疣局部表现易与尖锐湿疣混淆,灶状分布空泡细胞及HPV检验阳性是尖锐湿疣诊断和鉴别诊断的重要依据,据此可提高尖锐湿疣临床诊断的准确性.
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人胚胎肝脏褪黑素受体的鉴定
目的:应用免疫组织化和核酸原位杂交技术检测人胚胎肝脏的MEL受体及其亚型分布,为进一步研究MEL对肝脏功能的调节作用提供证据.方法:1.研究对象:中期水囊引产人胎儿,取出心脏和主动脉,立即用4%多聚甲醛+0.1%DEPC固定,石蜡包埋组织,4℃冰箱贮存待检测.2.MEL探针制备:培养含有MEL1A或MEL1B受体质粒的大肠杆菌,抽提质粒,酶切,地高辛标记探针(宝灵曼公司).3.核酸分子原位杂交:原位杂交检测试剂盒、APES、Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)和专用盖玻片均购自武汉博士德生物工程公司、APES与Poly-L-Lysine 联合应用处理载玻片.按原位杂交试剂盒的说明进行检测.实验设不加探针为阴性对照.4.免疫组织化学法:一抗为鼠抗人MEL1A和MEL1B受体单克隆抗体,由香港大学生理系彭树勋教授馈赠.免疫组化试剂盒购自福建迈新公司.MEL1A和MEL1B受体单克隆抗体的稀释浓度为1∶75,以缓冲液代替第一抗体作为阴性对照,下丘脑组织作为阳性对照.结果:1.肝脏MEL1A和MEL1B受体蛋白的检测:肝脏免疫组织化学染色结果显示,在人胚胎肝脏细胞存在MEL1A和MEL1B受体蛋白,分布于细胞膜和胞核,但以胞膜为主.2.肝脏MEL1A受体和MEL1B受体mRNA的检测:肝脏的核酸分子原位杂交结果显示,在肝细胞的胞核和胞浆均存在MEL1A和 MEL1B受体mRNA的表达,但以胞核为主.结论:肝细胞的胞膜和胞核存在MEL1A和MEL1B受体蛋白,同时在胞浆和胞核检测到MEL1A受体和MEL1A受体mRNA的表达,提示肝细胞存在MEL1A和MEL1B受体,从而证实了肝脏是MEL作用的外周靶器官.
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人胚胎甲状腺褪黑素受体的鉴定及生物学特性
目的:应用免疫组化和核酸原位杂交技术检测人胚胎甲状腺的MEL受体及其亚型,为进一步研究MEL对甲状腺功能的调节作用提供证据.方法:1.研究对象:中期水囊引产人胎儿,取出甲状腺,立即用4%多聚甲醛+0.1%DEPC固定,石蜡包埋组织,4℃冰箱贮存待检测.
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复发转移乳腺癌中FAK、Ezrin、Paxillin、Integrinβ3表达的意义及其与 ERK/MAPK通路关系的研究
目的:探讨在复发转移乳腺癌中ERK /MAPK通路的激活情况以及FAK、Ezrin、Paxillin、Integrinβ3 表达的意义及其与ERK /MAPK通路激活的关系.方法:收集1994～2006年住院接受根治手术的女性乳腺癌患者共100例,进行随访.分两组:实验组为术后复发转移者共46例,对照组为手术时间及发病年龄相近的术后未发生复发转移者共54例.常规病理蜡块切片,应用免疫组化、核酸原位杂交技术,检测ERK、FAK、Ezrin、Integrinβ3、Paxillin在两组中表达情况.结果:ERK 、FAK、Ezrin、Integrinβ3在实验组中表达率均较对照组高(均P<0.05),实验组中ERK的表达分别与FAK、Ezrin呈正相关(均P<0.05).多因素分析显示ERK、FAK、Ezrin是乳腺癌根治手术后复发转移的独立危险因素.结论:复发转移乳腺癌中,ERK/MAPK通路明显激活;Ezrin、FAK协同作用激活ERK/MAPK通路.FAK、Ezrin、Integrinβ3可作为乳腺癌术后复发转移的独立预测指标.
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核酸原位杂交技术检测尖锐湿疣中HPV病毒的临床意义
尖锐湿疣是由人乳头状瘤病毒(HPV 6、13/11型)引起的性传播疾病,临床上很难与假性湿疣及慢性皮肤营养不良性疾病区别,在普通光镜下难以确诊或易造成误诊,本文应用核酸原位杂交技术检测尖锐湿疣中HPV病毒,旨在为临床早期诊断、鉴别诊断及判断预后提供理论依据.
