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定向编辑CTLA4基因的向导RNA体外合成体系的构建及其编辑效率
目的:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术原理体外合成定向编辑细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)基因的向导RNA(small guide RNA,sgRNA).方法:(1)使用Crispr网站对CTLA4位点的sgRNA进行预测并设计出3个sgRNA (sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3),构建sgRNA重组质粒,将其转染293T细胞,48 h后提取基因组DNA,利用T7EN1核酸内切酶筛选活性较高的sgRNA序列;(2)以筛选到的sgRNA重组质粒为模板,设计引物并用PCR扩增体外合成sgRNA的DNA模板片段,进一步优化体外转录条件,转录出sgRNA,并利用Cas9核酸酶体外检测转录纯化sgRNA的切割效率;(3)将sgRNA与转录得到的Cas9 mRNA电转化入肺癌患者CD3+T细胞,实现靶基因敲除.结果:T7EN1核酸内切酶实验证实了sgRNA2序列靶向敲除效率高,效率达到66％;优化体外合成体系后,转录得到的CTLA4 sgRNA2产量高,具有较高的活性,在靶点上成功切开了DNA双链,Cas9核酸酶检测出其切割效率达到了65％;终可在肺癌患者CD3+T细胞中有效敲除CTLA4基因,CTLA4分子的表达从46％降低到22％,T7E1核酸内切酶实验进一步证实了其编辑效率为56％.结论:体外成功构建了具有较高编辑效率的定向编辑CTLA4基因的sgRNA,为后续针对该基因制定相应的免疫治疗策略奠定了基础.
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Crispr/Cas9技术在CHO细胞中基因敲除的应用
Crispr/Cas9技术是近年发展起来的基因编辑技术,已经在人、动物、植物等各类细胞中得到广泛应用.本文基于文献和本实验室研究成果,介绍了Crispr/Cas9技术在CHO细胞中运用的基本操作方法,以及与重组蛋白表达相关的基因敲除实例,对可能遇到的问题做出了技术解释.笔者认为可利用Crispr/Cas9技术对CHO细胞进行改造以创造出新的工程细胞株,为生物药物开发及生产服务.
关键词： CRISPR/Cas9技术 CHO细胞 向导RNA 生物药物研发
