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肾癌T7噬菌体展示肽库构建的实验研究
目的:构建肾细胞癌T7噬菌体展示肽库,为下一步筛选肾癌早期诊断分子标志群打下基础.方法:用传统Trizol方法分别抽取31例涵盖各种组织类型肾癌组织标本的总RNA,确定完整性后再根据OD值等量混合总RNA,用试剂盒完成mRNA的分离并电泳检测其质量,经反转录、末端平齐、片段长短筛选、加接头、双酶切、去除多余接头和<300 bp的cDNA片段等步骤,再与T7Select10-3b载体连接、体外包装并扩增得到肾癌T7噬菌体展示cDNA文库.通过铺平板测定和PCR技术鉴定所建文库质量.结果:建成原始文库的库容量为5.0×107 pfu/mL,扩增后文库滴度为3.5×1012 pfu/mL,重组率为95%,插入片段为300～2 000 bp.结论:成功用T7噬菌体构建了高质量的肾癌cDNA文库,为筛选可用于临床早期诊断的肾癌特异标志奠定基础.
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小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库的构建
目的 构建小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库.方法 用Trizol试剂提取原代小鼠神经细胞总RNA,分离、纯化mRNA,经反转录合成其双链cDNA.在双链cDNA末端加上定向EcoR Ⅰ/HindⅢ接头,用内切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ消化接头,以形成两端分别带有EcoR Ⅰ和HindⅢ黏性末端的双链cDNA.经Mini Column进行纯化,收集大小在300 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于含有EcoR Ⅰ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体上,体外包装后经BLT5403菌株增殖,进行文库扩增.结果 所构建的文库库容量为含有3.04× 107个重组子,原始滴度为2.8×107 pfu/ml,重组率为92%,扩增后文库滴度为3.5×1010 pfu/ml.对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,88%的插入片段大于300 bp.结论 成功构建了小鼠神经细胞cDNA T7噬菌体表面展示文库.
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表皮生长因子受体为靶向重组T7噬菌体抗肿瘤疫苗的构建
目的:构建表皮生长因子受体(EGFR)为靶向的重组T7噬菌体抗肿瘤疫苗.方法:通过RT-PCR克隆EGFR基因膜外DNA片段,经测序鉴定正确,亚克隆3个不同的DNA片段插入T7噬菌体载体,构建重组T7噬菌体. 用PCR、SDS-PAGE和 Western印迹法鉴定构建的重组T7噬菌体.结果:目的DNA片段以融合蛋白形式表达,展示于噬菌体壳蛋白,Western印迹显示实验组重组T7噬菌体呈阳性信号.结论:构建的重组T7噬菌体融合表达了外源目的多肽,并保持了原有的功能活性.
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噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A 蛋白相互作用蛋白
目的：利用 T7噬菌体展示技术筛选与人肠道病毒71型3A 蛋白相互作用的蛋白。方法构建3A 蛋白的原核表达载体，表达并纯化3A 蛋白，以3A 蛋白为靶蛋白，应用 T7噬菌体展示技术对人肝细胞 cDNA 文库进行筛选，对筛选到产物进行DNA 序列分析及同源性研究。结果表达并纯化了3A 蛋白，经过4轮筛选后，选择37个阳性克隆，采用 T7特异性引物扩增插入片段，将 PCR 产物送公司进行测序。经过同源性分析，确定了2个与人肠道病毒3A 蛋白相互作用蛋白。结论通过 T7噬菌体展示技术可以得到与3A 蛋白相互作用蛋白，通过研究此蛋白的功能就可以初步推测出3A 蛋白可能的功能，为进一步研究人肠道病毒的致病机制鉴定了基础。
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噬菌体展示技术筛选干扰素α启动子DNA结合蛋白
目的筛选干扰素α(IFNα)启动子DNA结合蛋白,探讨IFN α基因表达调节的分子生物学机制.方法应用噬菌体展示技术,以IFN α启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果噬菌体经富集后,随机挑选40个克隆,成功构建了克隆载体,序列测定后经过同源性搜索,确定了和IFNα启动子结合的肝细胞蛋白,筛选到17种与IFN α启动子具有结合作用的蛋白.结论多种具有不同生理、生化功能的蛋白与IFN α启动子具有结合作用.
