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砷体外诱导人Jurkat T淋巴细胞的差异表达cDNA文库的构建
目的了解三氧化二砷(As2O3)诱导人T淋巴细胞的差异表达基因,探讨砷的免疫毒性和免疫抑制的机制.方法在体外用As2O3处理人Jurkat T淋巴细胞(5 μmol/L,24 h)后,应用抑制性消减杂交技术(SSH)和克隆技术构建差异表达的cDNA文库,用聚合酶链反应技术和测序技术鉴定阳性克隆.结果用SSH技术成功地构建了由As2O3诱导的Jurkat T淋巴细胞的差异表达基因的正向消减cDNA文库.经测序分析该文库含有30个基因片段,其中仅有1个是重复基因片段.与基因库的序列比较显示,这些基因序列的同源性在95%～100%.该文库的基因有:氧化代谢基因(包括磷酸丙糖脱氢酶、酰胺腺嘌呤二核苷酸4亚单位、焦磷酸合成酶、16S核糖体、琥珀酰CoA合成酶和ATP合成酶6),转录和翻译基因(包括多聚腺苷结合蛋白、泛醌素特异性蛋白酶14、核糖体蛋白L23、核糖体蛋白S15a、真核翻译起始因子3、Rab5相互作用蛋白、剪切因子和ADP-核糖体因子6样相互作用蛋白),与氧化应激相关的基因(铁蛋白重链和高泳动类蛋白2),与细胞分化或凋亡相关基因(髓细胞分化初期应答蛋白和凋亡相关蛋白),参与蛋白活化或信号传导的基因(酪氨酸激酶、丝氨酸激酶和磷脂酰4磷接头蛋白-1相关蛋白);5个功能不详的基因是KIAA0092、CGI-147蛋白、GCI-35、核磷蛋白Nopp34和与骨骼肌部分mRNA假设蛋白同源基因.1个在基因库中无同源序列的新基因.结论应用SSH技术成功构建了As2O3诱导T淋巴细胞差异表达基因的正向消减cDNA文库.并且发现以往在砷的研究中从未涉及的基因.基因功能分析结果提示,As2O3在诱导T淋巴细胞凋亡的过程中不但有多种基因参与,而且还有一些未知的基因也参与细胞凋亡或(和)细胞抗砷毒性作用的应答过程.
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羊种布鲁菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建
目的 构建羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA 文库.方法 培养的绵羊肺泡巨噬细胞经羊种布鲁菌 05/43 株侵染后,以 Trizol 试剂提取其总 RNA,用 cDNA 文库构建试剂盒构建巨噬细胞的 cDNA 文库.随机选取 cDNA 文库中的 18 个克隆进行表达序列标签 (EST) 序列测定,测序结果 用 BlastX 和 BlastN 软件在 GenBank 蛋白质库和核酸库中进行序列同源性比对.结果 构建的 cDNA 文库的库容量为1.192×106,重组率为 95.65%.18 个 EST 测序,12 个与 CD 抗原基因、细胞因子基因、蛋白酶基因等已知功能的基因序列相关,6 个为未知功能基因的 EST 序列.结论 成功构建了羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的 cDNA 文库,这将有助于阐明该菌株的致病机制.
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粪肠球菌sprE基因的功能研究
近有报道在肺炎链球菌发现HtrA(high-temperature requirement A)蛋白,与细菌克服高温、氧化和渗透压力有关.肠球菌原来属于D组链球菌,其许多特性与链球菌相似.肠球菌能否产生HtrA蛋白酶以及确切的功能目前尚不清楚.我们利用BLAST将肺炎链球菌HtrA蛋白酶编码基因与粪肠球菌染色体基因组进行同源性比较,发现粪肠球菌有一个全长为851 bp的开放性读框与肺炎链球菌htrA基因有较高的同源性.进一步从基因文库查找此开放性读框,发现它是编码粪肠球菌假定的丝氨酸蛋白酶基因,被命名为sprE.为了研究sprE基因的确切功能,利用基因敲除构建粪肠球菌sprE基因突变菌株,在不改变该细菌其它遗传性状的基础上,研究sprE基因在粪肠球菌抗高温和氧化作用.
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应用噬菌体随机肽库研究丙型肝炎病毒核心蛋白B细胞抗原表位
目的 探索利用特异多克隆抗体结合噬菌体递呈(phage display)随机肽库,进行病原体蛋白质的B细胞抗原表位研究.方法 采取特异抗原→特异多克隆抗体→相应抗原表位的技术路线.所选研究对象为丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白.实验分三步:(1)抗HCV核心蛋白多克隆抗体的制备.用活化的Sepharose 4B耦联重组的HCV核心蛋白,亲和层析纯化丙型肝炎病人血清中特异的抗核心蛋白多克隆抗体.(2)随机肽库的生物淘洗(biopanning).以纯化的多克隆抗体作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机七肽库.(3)阳性噬菌体克隆的鉴定.将筛选的噬菌体克隆进行ELISA检测、DNA测序以及竞争抑制试验等,后分析所获资料.结果 七肽氨基酸序列分析表明,HCV核心蛋白存在着至少3个B细胞抗原位点,其中19～25aa间(PQDVKFP)的线性表位是该蛋白的优势表位,证实了本研究策略的可行性.结论 本技术路线可以有效地进行HCV核心蛋白的B细胞抗原表位研究.由此推论,此方法也可移植于其它病原微生物抗原或自身抗原的表位研究,继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据.
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半合成抗体库的构建及鉴定
目的 构建半合成抗体库,不经免疫制备抗体. 方法 通过PCR法,从人胎肝DNA扩增基因组VH段基因,从Fd基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段,然后用重叠PCR法构建Fd库,与人轻链基因库组合构建成半合成抗体库. 结果 通过各种组合多次建库,获得总容量为4×108的半合成抗体库,其Fd段和轻链基因的重组率均大于90%,Fab表达率为50%.挑选20个克隆测定CDR3序列符合所设计的随机序列,用三种不同抗原进行筛选均得到了特异性噬菌体抗体. 结论 所构建的半合成噬菌体抗体库可以用于不经免疫制备抗体.
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人胰腺细胞cDNA 文库中丙型肝炎病毒NS4B 结合蛋白基因的筛选
目的 从人胰腺细胞cDNA 文库中,采用酵母双杂交方法 筛选HCV NS4B 包膜蛋白的相互作用蛋白.方法 人胰腺细胞cDNA 文库先进行扩增,随后纯化及鉴定,然后将鉴定好的人胰腺细胞cDNA 文库质粒转化入酵母菌株Y187.构建pGBKT7-NS4B 作为诱饵质粒,随之转化酵母菌株AH109,用色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109 与Y187,用四缺培养基及X-α-gal 筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果 使用PUBMED 进行序列比对.结果 成功构建pGBKT7-HCV NS4B 重组质粒,并从人胰腺cDNA 文库中筛选出7 种与HCV NS4B 蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5RAP3、辅脂肪酶、胰石蛋白、凝乳蛋白、弹性蛋白酶2A、糜蛋白酶和胆盐刺激酯酶.结论 HCV NS4B 蛋白可能通过与所筛选出前述蛋白中参与代谢过程的相关蛋白结合,影响糖、脂类代谢过程.
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儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因文库的构建和筛选
目的克隆和分离儿童急性淋巴细胞白血病（ ALL）差异表达基因，探讨小儿白血病的发病机制。方法 Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，抽取mRNA，逆转录成cDNA；经RsaⅠ酶切，实验组cD-NA被分成两组，分别与两种不同的接头连接后，与对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应（ PCR），提取、纯化PCR产物，与PT-Adv载体连接构建cDNA消减文库，利用PCR扩增、测序和同源性分析差异表达的序列。结果选取文库中60个克隆进行菌落PCR分析，可以检出大小为200～600 bp的插入片段。从中随机挑选20个克隆进行测序、生物信息学分析，其中18个克隆与已知基因有高度序列同源性，符合率为98％～100％，共编码17种基因。这些基因大多涉及基因表达调控、DNA损伤修复、细胞周期、物质代谢等，均与细胞增殖、分化有关。此外发现2个新基因。结论本实验表明我们已成功构建小儿ALL相关消减cDNA文库，为小儿ALL发病机制的研究奠定了基础。
关键词： 前体细胞淋巴母细胞白血病淋巴瘤 核酸杂交 基因文库 -
酵母单杂交技术的原理及应用
0引言酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法,通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因,或对DNA结合位点进行分析.运用此技术,能筛选到与DNA结合的蛋白质,并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列,而无需复杂的蛋白质分离纯化操作,故在蛋白研究中,具有一定的优势;而且,酵母属真核细胞,通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况.
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8～10周龄胎儿心脏cDNA文库大规模表达序列标签分析
目的:研究心脏发育过程中基因表达特点.方法:随机选择8～10周龄胎儿心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库的克隆进行表达序列标签(EST)测序,结果与基因库/欧洲分子生物学实验室/日本脱氧核糖核酸数据库(GenBank/EMBL/DDBJ)进行同源性比较,所获EST进行功能分类,并比较其与10～12周龄胎儿及成人心脏表达基因功能分类的不同.结果:2 338条EST中,1 614条69.03%与已知基因匹配,547条(23.4%)与其它EST或基因组DNA相似,177条(7.57%)是新EST.发现了不同心脏发育时期中基因表达的特点.结论:大规模EST分析是系统研究心血管系统不同发育时期基因表达特点的有力工具.
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成人动脉和心脏cDNA文库的构建及新全长cDNAs的克隆
目的:构建成人动脉和心脏互补脱氧核糖核酸(cDNA)文库,克隆多个新的全长互补脱氧核糖核酸(cDNAs).方法:应用成人动脉和心脏组织,采用Stratagene的建库试剂盒构建cDNA文库.将随机克隆5'端表达序列标签序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库进行同源性比较,新的全长cDNAs采用步移法完成全序列测定获得.结果:所建动脉cDNA文库包含2.4×106个独立重组克隆,插入片段平均长度为2.0 kb;心脏cDNA文库包含1.0×106个独立重组克隆,平均长度为1.8 kb.首批得到了8条新的全长cDNAs,已在GenBank登记注册.结论:构建符合要求的cDNA文库是克隆新的全长cDNAs的一条快速有效的途径.
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嗜热吸水链霉菌cDNA文库构建及其抗原相关基因的表达
目的 构建嗜热吸水链霉菌cDNA文库并进行表达序列标签(EST)测序,从中筛选具有毒力作用的基因进行体外克隆并诱导表达.方法 利用RNA转录5’末端转换技术构建致农民肺嗜热吸水链霉菌的cDNA文库,将平板内克隆进行编号,取前1020个克隆提取质粒,进行EST测序.用生物信息学方法分析EST测序结果并预测基因功能,从中筛选出可能引起人体免疫反应的毒力因子.将这些目的基因亚克隆入pET-28a载体,将重组子转化大肠杆菌BL21,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导相应蛋白的表达.结果 成功构建了较高质量的嗜热吸水链霉菌cDNA文库,得到有义序列978个,获得单一基因347个,其中2段基因分别与胸膜肺炎放线菌外膜蛋白、转铁蛋白B的同源性为51％和42％,其开放阅读框长度分别为1554 bp和726 bp,分别编码517和241个氨基酸.将2段基因亚克隆入原核表达载体中,IPTG诱导表达产物的相对分子质量分别为63 000和30 000.结论 所构建的嗜热吸水链霉菌cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,文库中的EST数据将有助于农民肺特异性毒力分子的进一步筛选.
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Aβ1-40诱导大鼠脑皮质与海马差异表达基因的克隆与鉴定
我们于2001年3～8月以β-淀粉样蛋白1-40(beta-amyloid protein,Aβ1-40)注入脑室建立大鼠AD模型,采用抑制消减杂交(SSH)技术构建Aβ诱导大鼠皮质与海马差异表达的基因文库,旨在探讨Aβ1-40神经元毒性的分子机制.
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2 338条胎儿心脏cDNA文库的表达序列标签测序分析
目的寻找在心脏发育过程中具有重要功能的新基因,并研究其表达模式的特点.方法随意选择8～10周龄胎儿心脏cDNA文库的克隆进行表达序列标签(ESTs)测序,结果与GenBank/EMBL/DDBJ核酸数据库进行同源性比较,其中与已知基因匹配的1 550条ESTs用来研究8～10周龄胎儿心脏基因表达特点,并将其与10～12周龄胎儿及成人心脏的基因表达模式相比较.结果所测2 338条ESTs中,69.03%与已知基因匹配,33.18%与其他ESTs或基因组DNA相似,7.57%既不匹配于已知基因,亦不与其他ESTs或基因组DNA 相似.发现了心脏发育过程中基因表达的某些特点.结论大规模随机选择cDNA克隆,并进行ESTs测序是寻找新基因和系统研究不同组织或同一组织不同发育时期基因表达模式的有力工具.
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肾癌抑制性消减文库构建及差异表达基因鉴定
目的应用抑制性消减杂交技术筛选人肾癌差异表达基因. 方法以786-0和HK-2为消减杂交对象构建人肾癌抑制性消减文库,挑选阳性克隆进行测序及Genbank BLAST分析.结果文库包含362个有插入片段的阳性克隆,随机分析50个克隆,其中2个为新基因,另48个源于36个已知基因,这些差异表达基因与肿瘤细胞的转录、翻译、增殖、凋亡、代谢、信号转导、血管新生、膜受体表达异常等有关. 结论该文库质量可靠,筛选出包括低峰度和新基因在内的肾癌差异表达基因,为进一步研究肾癌发生、发展机制奠定了基础.
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卵巢上皮性癌相关抗原的筛选和血清学检测
目的 构建卵巢上皮性癌(卵巢癌)腹水肿瘤细胞的cDNA文库,从中筛选能用于卵巢癌早期诊断和免疫治疗靶点的卵巢癌相关抗原.方法用3例卵巢浆液性囊腺癌、1例卵巢黏液性囊腺癌、1例卵巢子宫内膜样癌患者的腹水肿瘤细胞构建cDNA文库,采用改良的重组克隆表达抗原的血清学鉴定(SEREX)技术与抑制性消减杂交(SSH)方法相结合的策略从文库中筛选卵巢癌相关抗原基因,并对其进行酶切鉴定、核苷酸测序分析.采用重组肿瘤抗原的微型血清学检测(SMARTA)法检测筛选出的卵巢癌相关抗原与96例卵巢癌患者和96例正常妇女的血清中相应自身抗体的阳性反应情况.结果 经两轮血清学筛选和核苷酸测序分析,终得到55个候选的卵巢癌相关抗原基因片段,代表45个基因,分为6类:(1)与已知的卵巢癌相关基因同源的基因,如BARD1基因等;(2)与其他肿瘤相关基因同源的基因,如TM4SF1基因等;(3)在一些特殊组织中表达的基因,如ILF3、FXR1基因等;(4)与一些特殊功能蛋白基因同源的基因,如TIZ、C1D基因等;(5)与胚胎来源的基因同源的基因,如PKHD1基因等;(6)其余为在基因库GenBank中无同源序列可比对的未知基因,如OV-189基因等.TM4SF1、C1D、BARD1、FXR1、OV-189基因的噬菌体重组融合抗原与卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率分别为28%、21%、23%、23%、31%,与正常妇女血清反应的阳性率分别为9%、6%、5%、8%、13%,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);TIZ、FXR1、OV-189基因的重组抗原与卵巢癌患者血清中相应IgM型自身抗体反应的阳性率分别为26%、28%、18%,与正常妇女血清反应的阳性率分别为8%、11%、7%,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).FXR1、OV-189基因的重组抗原与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率(分别为34%、46%)高于Ⅲ～Ⅳ期者(分别为16%、23%),两者分别比较,差异均有统计学意义(P值分别为0.045、0.021);OV-189基因的重组抗原与高分化卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率(为67%)高于中～低分化者(为26%),两者比较,差异均有统计学意义(P=0.001).TIZ、FXR1基因的重组抗原与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者血清中相应IgM型自身抗体反应的阳性率(分别为40%、46%)高于Ⅲ～Ⅳ期者(分别为18%、18%),两者分别比较,差异均有统计学意义(P值分别为0.018、0.004).当联合分析TM4SF1、C1D、TIZ、FXR1基因的重组抗原的相应IgG型自身抗体及TIZ、FXR1基因的重组抗原的相应IgM型自身抗体(即自身抗体谱)时,诊断卵巢癌的敏感度为66%,准确度为73%;将该自身抗体谱与CA125联合时,敏感度、准确度均有明显提高,分别为83%、80%.结论 SEREX技术与SSH方法相结合筛选肿瘤抗原基因是一种行之有效的、能筛选出具有较高特异性肿瘤抗原基因的研究策略;TM4SF1、C1D、TIZ、BARD1、FXR1、OV-189基因的重组抗原在血清中的相应自身抗体可作为卵巢癌诊断的标志物,多个抗原的联合检测可提高诊断效率.
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人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究
目的:分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因,探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制.方法:采用抑制性消减杂交技术(SSH),构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库;随机挑选部分阳性克隆测序,与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析,并进一步探讨基因功能.结果:成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库,并分离出多个差异表达基因片段:其中1条与染色体序列相似,可能代表未知的新基因序列,已被GenBank接收(注册号:CN446913);其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段.结论:1)SSH技术是分离差异表达基因的有效方法;2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关;
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肿瘤敏感相关基因克隆cDNA消减文库的构建
目的:烷基磷脂类化合物(十六烷基磷酸胆碱,HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药.方法:用抑制消减杂交技术,构建KB和KBr cDNA消减文库.KB为tester cDNA与过量的KBr cDNA消减杂交,非特异性cDNA片段被有效消减,特异表达的文库得到富集.结果:扩增后得到127个克隆,挑取质粒,酶切分析均得到400～800 bp插入片段.在获得可分析的78个克隆中,27%没有同源基因片段或同源性很低,暂定为"新基因";14%具有染色体明确定位,应该认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段;19%在人类EST文库MGC和CGAP中出现,可能是肿瘤细胞所特有基因;发现与耐药性相关的已知功能基因高达40%.结论:探索伴随肿瘤细胞耐药发生基因丢失,以开拓抗性逆转措施的新途径.
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鼻咽上皮组织定向cDNA文库的快速构建
目的采用SMART (switching mechanism at 5′ end of RNA transcript)技术，快速构建了高质量的成人鼻咽上皮组织定向cDNA文库。方法从成人正常鼻咽上皮组织分离总RNA，利用经修饰的oligo（dT）引物（含sfi IB酶切位点）合成cDNA第一链，同时根据真核生物mRNA 5′端帽子结构特点，利用SMART核苷酸（含sfi IA酶切位点）作为cDNA第二链在mRNA 5′端延伸出去的模板，进而以此序列为引物利用LD-PCR（Long-distance-PCR）合成双链cDNA，双链cDNA经sfi I(IA & IB)酶切和过柱分级分离后，克隆入经sfi I酶切的λTripIEX2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果获得1.5×106个重组子，重组率达100%。文库扩增后，滴度达3.8×109 pfu/ml，插入cDNA平均长度为1.5 kb。结论构建的成人鼻咽cDNA 文库具有良好的质量，该cDNA文库为进一步筛选、克隆鼻咽癌抑瘤基因及鼻咽组织特异性表达基因奠定了基础。
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大鼠视觉可塑性关键期终止相关基因的筛选
目的 筛选视觉可塑性关键期终止相关基因,探讨视觉可塑性关键期终止的分子机制.方法 采用暗饲养及暗饲养后加光照刺激动物模型,应用抑制性消减杂交技术构建大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库.并通过PCR筛选、反向Northern杂交验证、测序及同源性检索对差异表达基因进行分析.结果 成功构建了高消减效率的大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库,经筛选、测序及同源性分析,得到14个视觉可塑性关键期终止时视皮层上调表达基因的片段.其中13个为已知基因,除β-Tubulin、Mbp、Cyclophilin基因有文献报道跟可塑性有关外,其余基因与视觉可塑性的关系以往少有报道.结论 通过大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库的建立,筛选出一批与视觉可塑性关键期终止相关的候选基因,为进一步阐明视觉可塑性关键期终止的分子机制提供了重要的基础.(中华眼科杂志,2007,43:823-828)
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兔眼慢性高眼压模型视网膜损害相关基因的克隆及筛选
目的构建慢性高眼压条件下兔眼视网膜组织差异表达基因的消减cDNA文库并鉴定、克隆及筛选与慢性高眼压视网膜损害相关的基因表达片段.方法于兔眼前房注射1%甲基纤维素每周1次,连续5周,制作慢性高眼压模型.提取实验组和对照组兔眼视网膜组织总RNA及纯化mRNA.采用原位杂交技术,进行视网膜组织差异表达基因抑制性消减文库的构建及初步的基因筛选.对一个上调的cDNA片段用地高辛标记,采用原位杂交的方法在实验组和对照组的视网膜中进行相关基因片段的细胞定位.结果成功构建慢性高眼压条件下兔眼视网膜损害相关基因的抑制性消减cDNA文库,经基因片段测序及同源性检索,得到有效基因序列16个,经NCBI-BLAST信息途径分析,发现高度同源序列(同源性>98%)2个.其中一个编号F9基因片段与Ras家族基因相似,原位杂交结果确定其大量表达于实验组视网膜神经节细胞及内核层细胞中,而对照组视网膜组织未表达.结论慢性高眼压条件下视网膜组织基因表达失调,F9片段在慢性高眼压视网膜损害过程中表达明显增高.建立慢性高眼压条件下视网膜损害相关基因的抑制性消减cDNA文库,可为今后青光眼视神经损害机制及视神经保护的研究奠定基础.
