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人表面活性物质蛋白B基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建及活性检测
目的 构建人表面活性物质蛋白-B (SP-B)基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒,并分析其在H441细胞中的转录活性.方法 (1)以人基因组DNA为模板,PCR扩增SP-B启动子(-218/+435 bp)序列片段,并通过TA克隆方法连接到pGM-T载体上,筛选阳性克隆将目的片段进行测序.测序鉴定正确后的目的片段被克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic上构建pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒,酶切及测序鉴定重组质粒；(2)将构建的pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒酶切改造,SP-B启动子克隆进pGL4.17载体构建pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒；经酶切及基因测序确认无误后,采用脂质体法将构建的两种重组质粒分别和内参质粒pRL-TK同时转染H441细胞,检测双荧光素酶活性.结果 构建的重组质粒经酶切及测序鉴定完全正确,转染H441细胞后,检测细胞裂解液萤火虫荧光素酶(firefly)及海肾荧光素酶(renilla)活性,两者比值间接反映启动子活性,pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒的firefly/renilla比值(2.8±1.1、66.5±3.8)较空载体质粒pGL3-basic、pGL4.17(0.2±0.1,4.3±0.4)均明显升高(t=4.182,27.419,P=0.000).pGL4.17重组质粒firefly/renilla比值明显高于pGL3-basic重组质粒,其差异有统计学意义(t=27.712,P=0.000).结论 成功构建具有SP-B基因转录活性的pGL3-basic/pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒,pGL4.17重组质粒荧光素酶活性高,为后续研究SP-B基因转录调控奠定了理论基础.
