国产河豚毒素的毒性测定

河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是作用于钠离子通道的高毒神经性毒素,人畜误食含毒鱼类易致中毒或死亡.我们报道了国产TTX对小鼠和家兔(po)的毒性资料及中毒特征.为研究抗TTX的实验疫苗效果奠定了基础.

河豚毒素与钠离子通道的相互作用/河豚毒素在小鼠体内分布及代谢动力学/δ-睡眠肽和芋螺毒素的药理作用/刺尾鱼毒素对大鼠神经肌接头突触的传递/刺尾鱼毒素细胞毒性的作用

河豚毒素及其衍生物在织纹螺体内的解剖分布初探

目的 初步探讨织纹螺体内河豚毒素(TTX)及其衍生物在不同组织中的分布特征.方法 以2004年导致福建仙游地区中毒事件的肇事种红带织纹螺(Nassarius succinctus)为研究对象,将其软组织分为食道、肌肉和内脏三部分,运用液相色谱一质谱联用仪进行毒素分析.结果 织纹螺的食道、肌肉和内脏组织中均舍有TTX、脱水河豚毒素、三脱氧河豚毒素、单脱氧河豚毒素和加氧河豚毒素等成分,以色谱峰面积为准,trideoxy TTX)(在各组织中所占比例高,85%以上TTX次之.三种组织相比,TTX在内脏中所占的比例高,而三脱氧毒素在肌肉中所占的比例高.结论 织纹螺不同组织中的河豚毒素及其衍生物的含量与组成情况存在一定差异,这可能是织纹螺对河豚毒素的分配与代谢转化过程的反映.

河豚毒素对小鼠和家兔的毒性研究

为研究抗河豚毒素(TTX)的实验疫苗.测得昆明小鼠经ip,sc,ig 三种TTX中毒途径的LD50分别为10.7、12.5、532 μg/kg;LD99分别为12.5、14.6、622 μg/kg.毒性反应具性别差异,♂性比♀性更敏感;无明显蓄积毒性.报告了大耳白家兔经im、iv TTX中毒毒性,小致死剂量(MLD)分别为5.3、3.1μg/kg;全死剂量(LD)分别为5.8、3.8μg/kg.描述了两种动物及各种途径中毒的症状特征.小鼠毒性剂量反应关系曲线均非常陡峭,家兔的MLD与LD非常接近,提示在致死量中毒时免疫抗毒较易实现,而在高倍致死量时要困难得多.TTX经口服中毒死亡潜伏期长,中毒者具备急救的有利时机.

应用随机肽库筛选展示河豚毒素模拟表位噬菌体

目的 利用噬菌体随机肽库筛选展示河豚毒素(TTX)模拟抗原表位的噬菌体,并以其替代毒素建立免疫学检测方法.方法 以抗TTX单克隆抗体为靶分子,从以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表面的随机七肽库中进行生物亲和淘选,用ELISA法鉴定阳性克隆.结果 通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到3株能抑制TTX的阳性克隆.其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1-20ng/ml(TTX毒素浓度),R2=0.9947,检测下限为1ng/ml.结论 从噬菌体七肽库筛选到了展示TTX模拟抗原表位的噬菌体,淘选出来的噬菌体粒子可作为毒素的替代品用于免疫学检测.

基于不同载体免疫原制备河豚毒素抗体的研究

目的 比较牛血清白蛋白(BSA)和匙孔型血蓝蛋白(KLH)两种载体蛋白合成的河豚毒素人工抗原的免疫原性,并对其制备的抗体进行研究.方法 用曼尼希法将半抗原河豚毒素(TTX)分别与大分子载体BSA和KLH偶联合成人工抗原TTX-BSA及TTX-KLH,免疫6～8周龄Balb/c雌性小鼠,制备多抗;以卵清白蛋白(OVA)为载体蛋白,同样用曼尼希法制备包被抗原TTX-OVA.TTX-KLH多抗血清同时采用TIX-OVA和TTX-BSA作包被抗原检测,抗血清经间接酶联免疫吸附法(iELISA)以及间接竞争酶联免疫吸附法icELISA)检测.结果 经TIX-KLH免疫获得的多抗血清较TIX-BSA免疫获得的多抗血清特异性高.两种包被抗原的检测效价一致:均为1∶64000,而以TTX-OVA为包被原的检测值稍高,与TTX进行竞争酶联免疫检测,其IC50值波动范围为10～20ng/ml.结论 TTX-KLH具有更好的免疫原性.

电压敏感荧光染料在鱼贝类毒素检测中的应用初探

目的 建立快速、简便、能反映样品整体毒性的鱼贝类毒素筛查方法.方法 以神经母细胞瘤细胞为实验材料,采用电压敏感荧光染料bis-oxonol,根据膝沟藻毒素2,3(GTX2,3)、短裸甲藻毒素(BTX)和河豚鱼毒(TTX)的毒理特点,观察不同浓度毒素作用下细胞荧光的变化.结果 GTX2,3的浓度在2～ 200ng/ml范围内,TTX的浓度在20～600ng/ml范围内,BTX的浓度在15～400ng/ml范围内,培养体系荧光强度与毒素的浓度之间存在很好的线性关系.结论 利用电压敏感荧光染料法可实现对GTX2,3、TTX和BTX的快速检测.

免疫亲和柱净化-液相色谱柱后衍生荧光法测定人尿液和血浆中河豚毒素

目的 建立液相色谱柱后衍生荧光检测法测定尿液和血浆中河豚毒素(TTX)的分析方法.方法 样品经免疫亲和柱净化浓缩10倍后进样分析,色谱柱为Zorbax Bonus RP柱(4.6mm×150 mm,3.5μm),流动相为含10 mmol/L庚烷磺酸钠的60 mmol/L乙酸铵水溶液(pH5.0),4 mol/L NaOH 120℃柱后衍生,荧光检测器于激发波长385 nm,发射波长505 nm处进行检测.结果 尿液和血浆中TTX的线性范围均为1.0 ～ 400 ng/ml,相关系数优于0.999,样品的检出限(S/N=3)均为0.3ng/ml,定量限(S/N=10)为1.0 ng/ml,4个浓度水平加标的平均回收率分别在94％～98％和92％～95％之间,相对标准偏差为1.2％～5.5％和2.0％～6.8％(n=5).结论 方法准确、灵敏、选择性强,适用于尿液和血浆样品中河豚毒素的中毒检测,已应用于实际样品的测定,取得满意结果.

别吃超过三斤的深海鱼,当心雪卡毒素!

比河豚毒素强100倍的雪卡毒素雪卡毒素是鱼类因大量摄食有毒藻类,而在体内积累的大分子聚醚神经毒素,属于神经毒素,是已知的危害性较严重的赤潮生物毒素之一.目前,已发现3类雪卡毒素:太平洋雪卡毒素、加勒比海雪卡毒素和印度雪卡毒素.在食用了含有这种毒素的鱼类12～14小时后,一半以上的中毒患者会出现胃肠道的不适症状,表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻.这与一般的食物中毒现象很类似,而雪卡毒素中毒,显著的特征是神经系统紊乱,表现为冷热感颠倒和“干冰”“触电”的感觉;其次还有心血管系统症状:心跳加快或迟缓,精神方面出现幻觉,做恶梦;还有诸如身体失衡,头痛,盗汗,眩晕,有刺痛感等其他症状.目前,还没有特异性抗毒素方法,且不能事先免疫.

抗河豚毒素单克隆抗体联酶前纯化条件优化的研究

目的 了解不同辛酸浓度下盐析法、不同离心力对抗河豚毒素(TTX)单克隆抗体的纯化效果以及纯化后酶标抗体性能的影响,优化出纯化抗TTX单克隆抗体的方法,为免疫学方法检测TTX提供依据.方法 在传统辛酸-硫酸铵蛋白纯化方法的基础上进行改进,考察不同的辛酸浓度、不同的离心力对抗TTX单克隆抗体纯化效果的影响,并将纯化后抗体与辣根过氧化物酶(HRP)连接,用间接竞争酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测酶标抗体的生物学活性及各项性能指标并比对.结果 不同方法纯化获得的抗体及其酶结合物的各项指标参数、活性不同,当腹水稀释液与辛酸体积比为1 000∶11、纯化过程中离心力10 000 r/min时纯化获得的抗体虽然产量有所下降但纯度较高,酶标抗体的生物活性、各项指标均优.结论 经过对抗TTX单克隆抗体纯度、抗体中蛋白含量、酶标抗体各项性能指标的对比,优化出用于抗TTX抗体纯化用腹水稀释液与辛酸比值1 000∶11 (V/V)、离心力10 000 r/min的试验条件.

用昆明小鼠定量测试河豚毒素的研究

为建立昆明小鼠定量测定河豚毒素(TTX)方法,选用雄性昆明小鼠进行研究,结果显示:TTX致昆明小鼠的LD50为0.165μg,TTX剂量在0.45～2.56 μg之间与昆明小鼠平均死亡时间成线性关系;当河鲀鱼样品提取液TTX浓度低于0.45μg/ml时,腹腔注射1 ml提取液致小鼠平均死亡时间大于4 min,在此范围内与ICR小鼠进行比较,毒素检测结果基本一致.此外对该传统实验方法进行了无需小鼠体重校正、利用平均数计算等项改进.用昆明小鼠定量测试河豚毒素既方便又可靠.

(鱼屯)毒鱼类中河(鱼屯)毒素直接竞争抑制性酶联免疫吸附试验测定方法的研究

为检测(鱼屯)毒鱼类中的河(鱼屯)毒素,建立了用抗河(鱼屯)毒素单克隆抗体检测河(鱼屯)样品中河(鱼屯)毒素的直接竞争抑制性酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.结果表明,直接ELISA法较间接ELISA法灵敏,低检出浓度为0.1 ng/mL(每检测孔0.01 ng),线性范围为5～500 ng/mL,方法的加标回收率为73.0%～118.0%.本法与传统的小鼠生物试验相比,两种方法的测定结果之间在统计学上差异无显著性(配对t检验,P>0.1),并具有良好的相关性(r=0.944).对来自江苏省东海和长江水域的河(鱼屯)样品的毒力进行了测定,结果表明本方法简单、快速、灵敏,完全可以满足实际工作的需要.

高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定鱼体中河豚毒素

目的 建立高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪多反应监测技术(MRM)测定鱼体中的河豚毒素(TTX)含量的方法.方法 海鱼样品用80％酸化甲醇水溶液(含0.1％乙酸)超声提取,二氯甲烷脱脂净化,超滤管离心,取滤液过膜后进行分析.目标物TTX以pH =3.5的乙腈-0.06％甲酸铵溶液(65∶35,V/V)为流动相,经HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm,3μm)等梯度洗脱分离,采用电喷雾离子源,选择质谱多反应监测正离子模式,以保留时间和河豚毒素的二级质谱特征碎片离子予以双定性确证,基质标准曲线校正,外标法定量.结果 河豚毒素与杂质能良好分离,在0.10～2.0mg/kg范围内线性关系良好(r=0.997),方法检出限为0.012 mg/kg,定量限为0.041 mg/kg,加标回收率为75.7％ ～ 108.1％,相对标准偏差为1.4％ ～5.1％.应用该方法对20份实际样品进行检测,均未检出TTX.结论 本方法准确、快捷、简便,可应用于食物中毒因子识别与鉴定.

织纹螺中河豚毒素限量研究

目的 提出织纹螺中河豚毒素的限量建议值,为日常监控提供判定依据.方法 对织纹螺中河豚毒素的来源、含量情况、毒性、检测标准以及国内外有关河豚毒素、麻痹性贝类毒素的规定等文献资料进行分析比较,探讨织纹螺中河豚毒素的限量要求.结果 织纹螺可分为有毒织纹螺、无毒织纹螺、季节性有毒织纹螺,织纹螺中河豚毒素的浓度范围为0～177 mg/kg,而且河豚毒素毒性是麻痹性贝类毒素的30倍以上(以两者对小鼠的经口LD50比较).对光织纹螺、正织纹螺等常年带毒且毒素含量高的有毒织纹螺应有效识别并禁止采捕、销售、食用,建议无毒织纹螺和季节性有毒织纹螺中河豚毒素的限量为0.05 mg/kg,测定方法采用GB/T 23217-2008《水产品中河豚毒素的测定》.结论 提出织纹螺中河豚毒素的限量建议值应合理可行,有效地完善了织纹螺中河豚毒素的监控体系,保障广大公众的身体健康与生命安全.

生物毒素和中毒控制中常见毒物快速测定技术研究简介

为改变生物毒素和中毒控制领域常见毒物的检测缺乏快速、灵敏、简便技术的现状,选择该领域有代表性的难新问题进行攻关.分别建立了检测粮油食品中AFB1的2个ELISA方法,低检出浓度分别为0.01μg/kg和0.1 μg/kg,回收率均在80%以上,同时研制出拥有我国自主知识产权的2个AFB1 ELISA试剂盒,建立了2条年产量分别为1.5万盒和2000盒的生产线.建立了检测河NFDA8鱼中河豚毒素的直接和间接ELISA方法,低检出浓度分别为0.1 μg/L和1 μg/L,回收率均高于70%.研制出基于直接法的河豚毒素 ELISA试剂盒,筛选出了国产可食的河NFDA8鱼种.建立了检测粮食中伏马菌素B1的ELISA方法,低检出浓度为5 μg/L,回收率75.24%～117.65%,研制出检测伏马菌素B1的ELISA试剂盒.建立了食品和中毒样品中亚硝酸盐、甲醇等20种毒物的快速检测方法,所建方法与国标法相比检测结果差异无显著性,但检测时间缩短50%以上、检测成本降低80%～95%.自行设计研制出便携式智能化微型光电比色仪和光反射传感器,与建立的20种毒物快速检测技术配套使用,实现了中毒样品的现场智能化、自动化快速定量检测.研制出携带方便、便于中毒现场使用的毒物检测箱,建立了一条年产量2000套的生产线.整个课题申请专利5项,批准2项;获奖2项;产生2项国家标准和1项企业标准.在国内外杂志上共发表文章28篇.快速检测技术各项指标均达到国际同等、国内领先水平.

有毒动植物中毒及预防

有毒动植物中毒,包括将有毒食物与无毒食物混淆而误食,或食用方法不当而引起人类中毒,如河豚鱼含有河豚毒素、毒蕈含有毒蕈碱等.还有些食品,在一般情况下,并不含有毒物质,但由于贮存不当,则可形成某种有毒物质,如马铃薯发芽后可产生龙葵素,食用后也可引起中毒.因此,对于有毒动植物及预防食物中毒加以了解,可以让我们吃得更加安全、健康.

河豚毒素实验疫苗的不同剂量对免疫效应的影响

目的为提高河豚毒素抗毒实验疫苗的效价,探索不同免疫剂量对免疫反应的影响.方法以河豚毒素(TTX)与中国鲎血蓝蛋白(TTH)的化学偶联物TTX-TTH免疫Balb/c小鼠,比较高低不同免疫剂量(分别为每次100和25 μg)对抗体质量和疫苗的抗毒效价的影响.以血清抗体质量和TTX攻毒效果检验疫苗的效价.结果低剂量组的抗体质量升速比高剂量组快.两者相比,单次抗TTX中毒效价:半数活存剂量分别为16×LD和11×LD,大耐受剂量分别为26×LD和22×LD;累积抗毒效价:半数动物分别可累计耐受40×LD和22×LD以上,测得大累计耐受剂量分别为104×LD和90×LD.结论 TTX的实验疫苗在不同免疫剂量方案均有效预防了TTX的攻毒.低剂量组比高剂量组有更好的抗体质量、单次抗毒效价和累积抗毒效价.

急性河豚毒素中毒的神经电生理研究

我们对58例河豚中毒患者的神经电生理进行了检测,结果如下.一、对象与方法1.对象:病变组:58例,年龄23～62岁.食用河豚后1.5～8 h出现症状.轻度中毒18例,双手指、口唇、舌尖麻木或刺痛.中度中毒20例,表现为轻度中毒症状加四肢乏力,口唇、舌尖及肢端麻痹;重度中毒20例,表现为言语不清,呼吸困难,血压下降,意识障碍.对照组:60名健康成人,男35人,女25人,年龄20～65岁.

石墨化炭黑固相萃取-亲水液相色谱-三重四极杆质谱法测定海产品中河豚毒素

目的 建立石墨化炭黑固相萃取-亲水液相色谱-三重四极杆质谱法测定海产品中河豚毒素的检测方法.方法 将河豚鱼肉、肝和织纹螺肉样品经0.2％乙酸水溶液提取后(肝脏提取液需经HLB固相萃取柱脱脂),再经石墨化炭黑固相萃取柱净化,以含有2.0 mmol/L甲酸铵-0.1％(体积分数)甲酸的95％(体积分数)乙腈水液及含2.0 mmol/L甲酸铵的0.1％甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,在色谱柱上(Acquity UPLC BEH Amide,100 mm ×2.1 mm× l.7 μm)实现分离,正离子电喷雾多反应监测方式检测,基质标准外标法定量.结果 河豚鱼肉、肝和织纹螺肉中TTX的线性范围分别为30 ～ 10 000、50 ～ 10 000和30 ～ 10 000 μg/kg,相关系数为0.9963 ～0.9990;检出限分别为10、20和10 μg/kg,定量限分别为30、50和30 μg/kg；平均加标回收率分别为81.5％～93.1％、82.3％～106.0％和83.5％ ～95.2％,RSD分别为2.3％ ～ 11.0％、4.3％ ～14.0％和3.5％～13.0％(n=6).结论 本法简单、准确、灵敏,可应用于河豚鱼和织纹螺中TTX的测定.

蜀葵治疗河豚毒素中毒的临床疗效观察

蜀葵为锦葵科蜀葵属植物Althaea rosea (L) Cavan，又名熟季花、端午花，其性味甘、寒、无毒，全草均可入药，沿海一带渔民很早就用其救治河豚鱼中毒。我院从1994年开始将蜀葵煎剂用于河豚毒素中毒的抢救治疗中，取得了预期的临床效果，报道如下。1 临床资料1.1 一般资料 共观察86例Ⅰ,Ⅱ度中毒住院病人，临床随机分为治疗组与对照组。治疗组46例，其中男43例，女3例；年龄20～45岁，平均(31.85±4.62)岁。对照组40例，男39例，女1例；年龄21～47岁，平均(31.02±4.55)岁。所有患者入院前均有明确的摄食河豚鱼肉病史。发病潜伏期短30 min，长6 h；1～3 h发病者：治疗组39例，占84.78%；对照组35例，占85%。治疗组中熟食中毒者34例，生食中毒者12例；对照组中熟食中毒者30例，生食中毒者10例。