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河豚毒素的生物合成
介绍国内外河豚毒素研究的新动态一利用海洋细菌进行河豚毒素生物合成的研究,包括河豚毒素的来源、产河豚毒素的菌种及性质、培养条件及影响因素、代谢合成机理及未来的研究展望.
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河豚毒素的药理作用及临床应用
本文介绍了河毒素(TTX)的化特性、药理作用及临床应用.
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河豚毒素小分子拮抗肽的设计与鉴定
目的 用计算机辅助分子设计技术,设计河豚毒素(TTX)小分子拮抗肽,分别用免疫学方法和动物实验进行验证.方法 利用计算机辅助分子设计技术,对TTX的空间结构进行了优化;用分子对接确定了TTX关键位点;用分子模建设计了3个能与TTX结合的小分子拮抗肽;分别用竞争ELISA进行免疫学筛选;用动物实验进行中和活性测定.结果 成功设计了3个针对TTX的小分子拮抗肽并进行了多肽合成,用竞争ELISA筛选到针对TTX的小分子拮抗肽P2,拮抗肽P2浓度与TTX的结合能力成正比.动物实验中,针对TTX的小分子拮抗肽P2对注射2.5倍半数致死剂量TTX昆明小鼠的保护率为25％,起到了一定解毒效果.结论 获得了能与TTX特异性结合的中和性小分子拮抗肽,TTX浓度达到4.05μg/mL(LD50的2.5倍),TTX拮抗肽P2对实验组小鼠的保护率为25％.
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4-表河豚毒素的结构表征与毒力测定研究
目的 对制备获得的4-表河豚毒素(4-epiTTX)高纯样品进行结构确证与毒性测定.方法 采用LC-FLD检测法测定4-epiTFTX样品纯度,采用HRMS、1H NMR和13C NMR对样品进行结构表征；开展4-epiT-TX对小鼠的急性毒性试验.结果 4-epiTTX样品纯度为98.72％,样品的HRMS图谱信息与4-epiTTX相对分子质量吻合,1H NMR和13C NMR数据与文献报道相符；测得4-epiTTX对小鼠的半数致死量(LD50)为(350.83±4.11)μg·kg-1.结论 4-epiTTX与河豚毒素(TTX)的结构差别仅在于C-4上羟基为直立键.4-epiTTX有很强的毒性,但明显低于TTX的毒性,表明C-4上羟基的空间位置差异会影响毒素分子与受体的结合程度.
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河豚毒素单用及与吗啡合用对大鼠福尔马林致痛的影响
目的:探讨河豚毒素(tetrodoxin,TTX)单用及与吗啡合用的镇痛效应.方法:采用大鼠福尔马林致痛实验,分别单独肌注河豚毒素及将微量河豚毒素(0.39μg@kg-1,0.19μg@kg-)与吗啡联合给药,比较合用是否具有镇痛增强或协同效应.采用概率单位法计算镇痛的半数抑制量(ID50).结果:TTX的镇痛半数抑制量(ID50)为0.μg@kg;单用吗啡的ID50为2.6mg@kg-1;TTX 0.39μg@kg-1(1/50 LD50)和0.19μg@kg-1(1/100LD50)与吗啡合用,吗啡的镇痛ID50分别下降为0.5mg@kg-1,1.1mg@kg-1,联合用药的性质经检验具有协同作用.结论:河豚毒素对福尔马林所致疼痛具有镇痛作用,与吗啡联合应用具有协同镇痛效应.
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碳酸氢钠等治疗小鼠经口河豚毒素中毒的效果观察
目的:探讨碳酸氢钠、氢氧化钠、活性炭和中药防风对小鼠河豚毒素经口中毒的拮抗作用.方法:用小鼠死亡时间和死亡率评价碳酸氢钠等化合物拮抗河豚毒素效果.结果:碳酸氢钠、氢氧化钠、活性炭和中药防风可使小鼠50%～100%存活(P＜0.01).氢氧化钠拮抗效果比碳酸氢钠、活性炭和中药防风明显.中药与氢氧化钠、中药与碳酸氢钠、氢氧化钠与碳酸氢钠混合后,小鼠存活率均低于单独使用.结论:碳酸氢钠、氢氧化钠、活性炭和中药防风对小鼠河豚毒素经口中毒均有明显的拮抗作用.混合使用不如单独使用拮抗效果明显.
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碳酸氢钠等化合物对小鼠河豚毒素急性中毒的拮抗作用
目的:探索碳酸氢钠等化合物对小鼠河豚毒素急性中毒的拮抗作用.方法:用小鼠死亡时间评价碳酸氢钠等5种化合物拮抗河豚毒素效果.结果:碳酸氢钠和氢溴酸东莨菪碱对河豚毒素有明显的拮抗作用,可使小鼠100%或80%存活(P<0.01).碳酸氢钠拮抗效果比氢溴酸东莨菪碱明显.阿托品和半胱氨酸没有明显效果.结论:碳酸氢钠和氢溴酸东莨菪碱可试用于河豚毒素中毒的抢救.
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河豚毒素诱发小鼠骨髓细胞染色体畸变、小鼠骨髓细胞微核及小鼠精子畸变的研究
目的:探讨河豚毒素(TTX)的药用价值,检测其是否有潜在的致突变作用.方法:采用小鼠精子畸变试验、小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变试验进行观察.结果:河豚毒素未引起小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率、小鼠精子畸变率和小鼠骨髓细胞染色体畸变率增加,与阴性对照组比较无显著性差异(P>O.05),但3项试验的阳性对照组与阴性对照组比较,则有高度显著性差异(P<0.01).结论:提示TTX无致突变性.
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河豚毒素对钠通道的影响及其药理作用
河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)与石房蛤毒素(Saxitoxin)被称为海洋毒素的代表.TTX存在于河豚的睾丸、卵巢、卵、肝、脾、眼球和血液内.提取分离得到的TTX,在神经生理学、肌肉生理学、药理学等方面被广泛应用,是一种氨基全氢喹啉型化合物,其结构为一种笼形原醋酸类小分子非蛋白神经毒素,具有毒性强、活性和特异性高的生物学特性,是细胞膜上一种快速可逆的钠离子通道阻滞剂.
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免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定烤鱼片中河豚毒素
目的 建立免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定烤鱼片中河豚毒素(TTX)的检测方法.方法 样品经酸化甲醇提取,提取液经磷酸盐缓冲液稀释、免疫亲和色谱柱净化后,在ACQUITY UPLC BEH Amide柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)上进行分离,以5mmol/L乙酸铵溶液(含0.1％甲酸)-乙腈(30∶70,V/V)为流动相,电喷雾正离子多反应模式监测,外标法定量.结果 河豚毒素在0.5 μg/L ～ 50μg/L时具有良好的线性关系,相关系数＞0.995,检出限为0.3μg/kg,回收率为81.7％～92.6％,相对标准偏差＜10％.采用该方法对70份烤鱼片样品进行测定,其中9件样品中检出rrx,含量为9.12μg/kg～155 μg/kg.结论 该方法具有快速、灵敏、简便、准确等优点,适用于烤鱼片中河豚毒素的测定.
关键词： 河豚毒素 免疫亲和柱 超高效液相色谱-串联质谱法 烤鱼片 -
血浆中河豚毒素的衍生气相色谱质谱分析
目的 建立血浆样品中河豚毒素(TTX)的气相色谱-质谱分析方法.方法 采用3％乙酸甲醇溶液提取,Oasis MCX固相柱净化,样品液中加入3 mol/L KOH溶液和甲醇、DMF将河豚毒素转化成C9碱,经Oasis HLB固相萃取柱净化、再用硅烷化衍生剂(BSTFA+ TMCS)衍生,用气相色谱-质谱联用法进行定性定量分析鉴定.结果 方法定性的特征离子为m/z318、m/z376、m/z392、m/z407,定量离子为m/z392;定量测定的线性范围在5 ng/ml～200 ng/ml,相关系数在0.9998,检出限为1.0 ng/ml,定量限为5.0 ng/ml,血浆样品加标回收率为82.2％～94.7％,相对标准偏差为7.6％～8.8％.结论 建立的分析方法快速、准确、选择性好,可适用于公共卫生突发事件的应急检测和临床中毒病人的诊断确证.
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河豚鱼中河豚毒素的气相色谱质谱法测定
目的:建立河豚鱼中河豚毒素的气相色谱-质谱法定性、定量测定方法.方法:河豚鱼肉、内脏等用2%乙酸/甲醇提取出河豚毒素,正己烷脱脂,然后用碱将河豚毒素水解成2-氨基-8-羟基-6-羟甲基-喹唑啉(C9碱),水解液经过C18、SLH固相萃取柱净化、BSTFA衍生,采用气相色谱-质谱法全扫描方式测定,定量离子392.结果:样品添加0.25、1.0、5.0 mg/kg河豚毒素,方法回收率为51.2%～87.0%,RSD为4.7%～6.6%,方法低检测限为0.05 mg/kg.结论:建立的方法灵敏度高,定性定量准确,完全满足样品检测要求.
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7种有机酸溶液中河豚毒素的稳定性研究
目的:比较7种常用有机酸溶液中河豚毒素的稳定性.方法:将河豚毒素溶解在7种有机酸溶液中,进行高温加速实验,以高效液相色谱法进行河豚毒素含量分析.结果:河豚毒素溶液经10 d的高温加速实验后,含量下降13.05%～17.79%.主要转化产物为脱水河豚毒素.结论:河豚毒素具有热不稳定性,在溶液中的稳定性与溶液酸度密切相关.
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河豚毒素的高效液相/荧光精确定量技术研究
目的:建立高灵敏度检测河豚毒素的高效液相色谱-荧光法.方法:采用柱后衍生高效液相色谱-荧光法检测河豚毒素含量,以庚烷磺酸钠为离子对试剂,应用反相离子对液相色谱分离河豚毒素,采用在线柱后衍生系统,在110℃高温和4 mol/L NaOH强碱条件下,将河豚毒素衍生化成具有荧光特性的C9碱,荧光检测器定量检测.结果:河豚毒素在0.408～102.00 μg/ml范围内呈良好的线性相关,相关系数r=0.9999;方法的检测限为0.41 ng;定量限为0.81 ng;精密性试验相对标准偏差为0.29%;重复性试验相对标准偏差为1.87%;平均回收率为99.70%,标准偏差为1.87%.结论:本方法简单、可靠、灵敏,可用于微量河豚毒素的精确定量分析.
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抗河豚毒素单链抗体基因的构建、表达及活性分析
目的:构建抗河豚毒素(TTX)单链抗体表达载体并进行活性分析.方法:提取抗TFX单克隆抗体3D4杂交瘤细胞总RNA,根据鼠源单克隆抗体设计轻、重链可变区基因V1和VH引物并进行RT-PCR扩增,借助Linker(Gly4Ser)3连接成单链抗体TFX-ScFv(VH-Linker-VL)基因,克隆至表达载体pET-22b(+)后转入E.coli BL21(DE3)诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA检测表达蛋白的反应活性.结果:测序结果表明TYX-ScFv基因全长744 bp,经NCBI blast分析氨基酸序列符合鼠抗体可变区特征,其中VH366 bp,VL333 bp,Linker 45 bp,SDS-PAGE与薄层扫描分析显示表达产物相对分子量为26.045ku,表达蛋白以包涵体形式存在,表达量占菌体总量的42%;ELISA检测表明TTX-ScFv可与TTX特异结合.结论:成功构建了抗TTX单链抗体表达载体,表达产物具有一定的免疫学结合活性.
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浙江沿海地市典型海产品中河豚毒素含量调查与分析
目的 了解2013年-2015年浙江4个沿海地市典型海产品中河豚毒素的含量情况.方法 按照代表性、适时性和随机性原则,在网店、食品商店和农贸市场采集新鲜贝类、织纹螺和烤鱼片样本,采用亲水液相色谱-串联三重四极杆质谱法进行河豚毒素定量检测.结果 浙江沿海地市3大类典型海产品中,织纹螺样品河豚毒素检出率高(93.3％,14/15),浓度高达15.75 mg/kg;烤鱼片样品河豚毒素检出率为6.2％(10/161),高浓度为1.79 mg/kg,网店销售和散装烤鱼片的检出率相对较高;新鲜贝类样品均未检出河豚毒素(0/115).结论 浙江沿海地市织纹螺普遍存在河豚毒素,建议继续禁止销售和食用织纹螺;部分烤鱼片样本检出河豚毒素,相关部门应加强监管,以保证当地居民的身体健康.
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多起食用织纹螺中毒的流行病学调查
目的 调查分析多起食用织纹螺引起食物中毒事件的原因,探讨预防织纹螺食物中毒的方法,为制定防控措施提供科学依据.方法 2012年7月8日-7月10日共报告食物中毒患者21例,其中重症6例.现场流行病学调查分析,食物中毒与患者发病前食用的织纹螺高度相关.采集剩余织纹螺样品和患者尿样送实验室检测和实验室检测相结合的方法.结果 温州市龙湾区和瑞安市两地共报告的21例患者均为食用织纹螺中毒患者,临床表现为呼吸困难、全身乏力、四肢麻痹等症状,经对症治疗,治愈20例,死亡1例.4份患者尿液样本检出河豚毒素(TTX),其含量分别是135 μg/L、31 μg/L、5μg/L和3μg/L,1份食剩织纹螺样本中检出10.3 mg/kg的TTX.结论 根据现场流行病学调查,结合临床表现和实验室检测结果,确定该起食用织纹螺食物中毒事件为河豚毒素中毒.
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LC-MS/MS法测定中毒患者血液中的河豚毒素
河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种强神经毒素,它通过对钠离子通道的阻断作用而抑制神经冲动的传导,使感觉神经麻痹,四肢瘫痪,呼吸困难,后因呼吸抑制而死亡.河豚毒素对人的小致死量约为0.5 mg/60 kg体重,毒性比氰化钠大1000倍.河豚鱼虽然含有剧毒,但肉味鲜美,营养丰富而久为沿海地区的人们所喜爱,亚太沿海地区河豚毒素食物中毒事件常有发生[1～5].Nunez-Vazquez[6]报道了几起发生在美国和墨西哥的因食用来自大西洋的河豚鱼而导致TTX食物中毒.2009年欧洲发生了第一例因食用白法螺(Charonia sauliae)而引发的河豚毒素食物中毒事件[7].
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用小鼠单位法检测河豚毒素
本市发生一起由烤鱼片引起的食物中毒.经流行病学调查,从进食情况、发病时间及临床表现,疑似河豚毒素(TTX)中毒.追查到销售商店及生产厂家证实本批白色鱼片是用河豚鱼为原料加工制成的.我们用小鼠单位法对烤鱼片内河豚毒素进行了测试.
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亲水液相色谱-串联质谱法检测即食烤鱼片中的河豚毒素
目的 针对即食烤鱼片中毒原因分析这一迫切需求,利用亲水液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(HILIC-MS/MS)建立了快速定性定量检测即食烤鱼片中河豚毒素的方法.方法 取1.0g即食烤鱼片样品经0.1％甲酸溶液提取,HLB固相萃取柱净化后过膜,亲水液相色谱柱分离,电喷雾离子化,选择反应监测(SRM)模式检测,基质匹配外标法定量.结果 在2.5 ng/ml～ 100 ng/ml时河豚毒素呈现良好的线性关系,相关系数为0.9995;以3倍基线噪声所对应的浓度为检出限时,即食烤鱼片基质中河豚毒素的方法检出限可达10.0 μg/kg;在25 μg/kg、100 μg/kg和200 μg/kg的加标水平时,方法的回收率为73.4％～89.5％,相对标准偏差为2.9％～10.4％.结论 该检测方法准确、快速、易操作,能满足即食烤鱼片中河豚毒素的公共卫生应急检测或日常监测要求.
