不同毒力株弓形虫速殖子排泄分泌抗原(ESA)对小鼠自然杀伤细胞(NK)作用的比较

为观察不同毒力株弓形虫排泄分泌抗原(Excretory-Secretory antigen,ESA)对小鼠NK细胞的作用,将18只雌性C57BL/6J小鼠随机分为3组,各组每鼠分别腹腔注射刚地弓形虫RH株ESA 200 μL(含ESA 0.002 mg),PRU株ESA 200 μL(含ESA 0.002 mg)和PBS 200 μL.于注射后6天取脾,流式细胞仪检测脾脏NK细胞的比例,并用乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH )法检测各组NK细胞的杀伤活性,ELISA检测血清IFN-γ水平.结果显示,RH株ESA处理组NK细胞比例(5.97±0.26)%,PRU株ESA处理组NK细胞比例(3.32±0.29)%,两组均明显高于PBS对照组(3.08±0.39)%(P<0.001),其中RH株ESA处理组明显高于PRU株ESA处理组,差异有统计学意义(P<0.001);不同毒力株ESA处理的小鼠NK细胞杀伤能力较对照组有明显的升高,3组间差异有统计学意义(P<0.01);不同毒力株ESA处理后小鼠血清的IFN-γ水平升高,与PBS组相比差异有统计学意义(P<0.01),其中RH组小鼠血清中IFN-γ浓度较PRU组升高更为明显,差异存在统计学意义(P<0.05).结果表明,弓形虫ESA有活化小鼠NK细胞的作用,且RH株ESA的作用强于PRU株ESA.

STAg联合ESA鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用

观察弓形虫可溶性速殖子抗原(Soluble tachyzoite antigen,STAg)与排泄-分泌抗原(Excreted/secreted antigens,ESA)单独或联合鼻内免疫小鼠对弓形虫垂直传播的阻断作用.分别用PBS 20 μL和STAg 20 μg、ESA 20 μg及联合抗原(STAg 10 μg+ESA 10 μg)鼻内免疫BALB/c处女鼠2次,间隔2周.末次免疫后第13天处女鼠与雄鼠以2:1同居.妊娠第8天用弓形虫速殖子(8 000个/只)灌胃攻击所有孕鼠.妊娠第18天处死,计算活胎率,并测定孕鼠肝、胎盘和胎鼠脑组织弓形虫抗原和孕鼠脾组织内虫荷,同时测定孕鼠小肠冲洗液SIgA、血清IgG水平.结果表明,ESA组和联合抗原组活胎率显著高于PBS组,STAg组、ESA组和联合抗原组胎盘及胚胎感染率均低于PBS组,联合抗原组低.孕鼠在弓形虫速殖子攻击后,PBS组明显出现竖毛、倦怠、腹部塌陷等异常表现,感染率为100%,死亡率为22.22%,而STAg组、ESA组和联合抗原组有轻微症状.感染率分别为85.71%、57.14%、57.14%,死亡率分别为16.67%、0%、0%.STAg组、ESA组和联合抗原组脾组织内虫荷均显著低于PBS组,减虫率分别为72.19%、72.29%、78.45%,ESA组和联合抗原组小肠冲洗液特异性SIgA均显著高于PBS组,联合抗原组高,血清特异性IgG抗体水平差异不显著.由此可见,ESA单独或与STAg联合免疫可诱导孕鼠小肠液高水平SIgA,显著降低脾组织虫荷,显著提高胚胎存活率,表现出明显的垂直传播阻断的作用.

旋毛虫Hsp70与Ts87融合蛋白的构建表达及鉴定

本文构建并表达了旋毛虫热休克蛋白70（Ts－Hsp70）与排泄分泌抗原Ts87的融合蛋白，并对融合蛋白进行纯化和免疫学鉴定。本研究采用限制性内切酶EcoRⅠ酶切位点将目的基因Ts－Hsp70与Ts87相连接，插入pET28－a （＋）质粒，转入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达、纯化，获得的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87用Western blot的方法鉴定。经PCR、酶切鉴定、测序分析，结果显示，目的基因片段大小为2721 bp，构建的重组质粒与预期相符。经IPTG诱导表达，通过镍离子柱层析纯化复性后得到可溶的融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87，其相对分子质量约为100 kDa； Western blot结果显示，该蛋白可被抗His标签单抗、 rTs－Hsp70免疫血清、 rTs87免疫血清识别。以上结果表明，本研究成功构建并表达了融合蛋白rTs－Hsp70－Ts87，为进一步研究rTs－Hsp70－Ts87的免疫保护性，开发新的有效抗旋毛虫病的疫苗奠定基础。

不同剂量弓形虫ESA鼻内免疫小鼠诱导的粘膜及系统免疫应答

目的 观察不同剂量弓形虫排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigens, ESA)鼻内免疫小鼠诱导的粘膜及系统免疫应答,确定适宜免疫剂量. 方法 40只BALB/c小鼠,雌雄各半,随机分为5组,每组8只.分别用5、10、20和30 μg ESA滴鼻免疫小鼠2次,间隔14 d,对照组用20 μl/只PBS滴鼻.于末次免疫后第14 d,颈椎脱臼处死小鼠,ELISA法检测鼻咽冲洗液和小肠冲洗液sIgA、血清IgG抗体水平,分离并计数肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes, iIEL)、肠系膜淋巴结淋巴细胞(mesenteric lymph node lymphocytes, MLNL)及脾淋巴细胞. 结果 实验期间,小鼠健康状况良好.随鼻内免疫ESA剂量的增加,特异性抗体水平不同程度的升高,MLNL、iIEL及脾淋巴细胞也显示不同程度的增生性应答.其中,30 μg组小鼠血清IgG、脾淋巴细胞数量与10 μg组、5 μg组和PBS组比较,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);30 μg组小肠冲洗液sIgA、鼻咽冲洗液sIgA、iIEL和MLNL数量,20 μg组小肠冲洗液sIgA和MLNL数量与5 μg组及PBS组比较,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);20 μg组血清IgG与PBS组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 20 μg和30 μg ESA鼻内免疫能有效诱导粘膜及系统免疫应答.

抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定. 方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化.ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应.电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性. 结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株.电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM).B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1 280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高.2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应. 结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础.

应用免疫蛋白质组学方法鉴定弓形虫病诊断抗原分子的研究

目的 鉴定对弓形虫感染具有潜在诊断价值的弓形虫抗原分子.方法 制备刚地弓形虫RH株速殖子全虫可溶性蛋白及弓形虫感染小鼠腹腔蛋白,经SDS-PAGE分离后采用半干电转移方法将其转移到硝酸纤维素膜上,再分别与22份弓形虫感染者血清进行Western blot,以22份健康人血清和其他寄生虫病患者血清作为对照,筛选能被弓形虫感染者血清特异性识别的蛋白组分;两种蛋白样本经二维电泳分离后采用Western blot筛选能被弓形虫感染者混合血清识别,但不能被健康人血清及其他寄生虫病患者血清识别的特异性斑点.切取SDS-PAGE胶上相应的特异性蛋白质斑点进行MALDI-TOF分析,鉴定蛋白斑点的基因.结果 一维电泳及Western blot结果显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的90、37、30、28和18 ku组分分别可被部分弓形虫感染者血清识别,其中为28 ku蛋白能被22份弓形虫感染病人血清中的15份所识别;速殖子全虫可溶性虫体蛋白中的90、70、67、56、48、39、37、30、28和18 ku组分可被部分弓形虫感染者血清识别,其中28 ku蛋白可被22份弓形虫感染者血清中的21份识别,22份健康人血清中有2份与28 ku蛋白呈弱阳性反应,与其他寄生虫病患者血清无交叉反应.二维电泳Western blot阳性斑点的飞行质谱分析显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的28 ku组分为磷酸丙糖异构酶,弓形虫速殖子全虫可溶性蛋白中的28 ku组分为GRA2和GRA7.结论 弓形虫抗原与宿主抗体反应具有高度异质性,GRA2、GRA7及磷酸丙糖异构酶等分子的弓形虫感染者血清识别率高,此三种蛋白可作为建立具有高敏感性的弓形虫病特异性免疫诊断方法的抗原分子.

血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成及免疫反应性分析

目的 分析日本血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成及其与血吸虫感染兔疗前、疗后配对血清的免疫反应特征.方法采用7 cm(pH5～8)的IPG和12% SDS-PAGE对血吸虫成虫排泄分泌抗原的组成进行双向凝胶电泳分析,并用免疫印迹试验检测排泄分泌抗原各蛋白点与疗前、疗后血清的反应性;采用PDQuest8.0图像分析软件对二维图像斑点进行分析,寻找差异反应蛋白点. 结果 血吸虫成虫排泄分泌抗原双向凝胶电泳图谱主要由215个蛋白斑点组成,其中16个斑点大、染色深,可能为高丰度的循环抗原;免疫印迹显示可被感染6周兔血清识别,但不能被治疗12周兔血清识别的蛋白斑点有84个,与感染6周兔血清的反应强度比与治疗12周兔血清的反应强度高2倍的蛋白点有38个. 结论 血吸虫成虫排泄分泌抗原中存在高丰度的能被短程抗体识别的抗原分子.

小鼠实验感染不同种旋毛虫后血清IgG抗体水平的变化

目的 观察小鼠感染不同种旋毛虫后血清IgG抗体水平的变化. 方法 将50只小鼠随机分成5组(每组10只),分别感染旋毛虫(T1)、乡土旋毛虫(T2)、布氏旋毛虫(T3)、伪旋毛虫(T4)及纳氏旋毛虫(T7),每只感染300条幼虫,感染后1～6周每周尾部静脉采血,6周后每2周尾部静脉采血,至感染后20周,用旋毛虫肌幼虫ES抗原ELISA检测血清中抗旋毛虫IgG抗体水平. 结果 小鼠感染旋毛虫、乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及纳氏旋毛虫后3～5周,血清IgG抗体水平快速升高,至感染后第8周达高峰,此后旋毛虫和乡土旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平缓慢下降,布氏旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平迅速下降;小鼠感染伪旋毛虫后3～5周血清IgG抗体水平快速升高,至第16周达高峰,之后缓慢下降.5种旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平差异具有显著性(P＜0.05). 结论 5种旋毛虫感染小鼠的血清IgG抗体水平和动态变化不同;旋毛虫肌幼虫ES抗原可用于其他4种旋毛虫(乡土旋毛虫、布氏旋毛虫、伪旋毛虫、纳氏旋毛虫感染的血清学诊断及流行病学调查.

旋毛虫排泄分泌抗原的成分及应用价值

旋毛虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病,长期以来用于免疫诊断和免疫预防的旋毛虫抗原,尤其是排泄分泌(ES)抗原引起了国内外众多学者的关注.本文综述了近年来旋毛虫ES抗原有效成分的研究及其在免疫诊断和免疫预防方面的应用价值,并且提出应用DNA重组技术在体外大量表达ES抗原和利用多肽合成技术在体外大量合成抗原用于免疫诊断和免疫预防将是今后的研究方向.

旋毛虫成囊前期幼虫排泄分泌抗原的研究进展

在旋毛虫感染过程中,成囊前期幼虫(PEL)是旋毛虫侵入宿主肌肉的侵入期.旋毛虫PEL比成囊期幼虫(EL)在宿主体内约早2周出现.成囊前期幼虫抗原(PELA)对旋毛虫病的早期免疫学诊断具有较高的敏感性.而旋毛虫排泄分泌抗原具双重免疫功能,即有良好的抗原性和免疫原性.因此,本文就旋毛虫成囊前期幼虫ES抗原研究进展做一综述.

旋毛虫排泄分泌抗原的研究与应用

旋毛虫病是一种严重的人兽共患寄生虫病,由旋毛形线虫引起.自1835年发现旋毛虫病以来,为诊治和预防旋毛虫病,人们对旋毛虫抗原展开了广泛的研究.旋毛虫生活史复杂、抗原成分多样,根据解剖部位分为虫体抗原、表面抗原、杆细胞颗粒相关抗原以及排泄分泌抗原(ES抗原)等[1].其中ES抗原是旋毛虫的代谢分泌产物,与宿主免疫系统直接接触.

ESA与STAg联合滴鼻免疫小鼠诱导的特异性免疫应答

目的 观察弓形虫排泄分泌抗原(ESA)与可溶性速殖子抗原(STAg)联合或单独滴鼻免疫小鼠的免疫应答效果,筛选弓形虫黏膜疫苗候选抗原.方法 将40只BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只.实验组分别用20μg STAg、30 μg ESA及二抗原联合(15μg ESA与10 μg STAg)滴鼻免疫2次,间隔14d,对照组用PBS以20μl/只滴鼻.于末次免疫后第14天,取血清,收集小肠冲洗液,检测特异性抗体,分离肠上皮内淋巴细胞(iIEL)和脾淋巴细胞并计数.结果 整个实验期间,各组小鼠健康状况良好,体重逐渐增加.STAg组、ESA组及联合抗原组小鼠黏膜、血清中特异性抗体水平依次升高,脾淋巴细胞和iIEL增殖反应逐渐增强.联合抗原组和ESA组血清IgG抗体和小肠冲洗液sIgA升高尤为显著.同时,联合抗原组、ESA组脾淋巴细胞和iIEL增生显著高于对照组.结论 ESA单独或联合STAg滴鼻免疫小鼠均能激发弓形虫特异性黏膜及系统免疫应答.两种抗原联合免疫的研究,将有助于制定更加完善的弓形虫疫苗研究策略.

肝吸虫排泄分泌抗原对豚鼠腹膜MφNO产量的影响

目的:研究排泄分泌抗原(ESA)对豚鼠腹膜Mφ亚硝酸盐产量的影响方法:ESA与Mφ培养2小时后再加入LPS培养48小时,测上清液中NO含量.结果:实验组NO含量明显降低结论:ESA在肝吸虫的免疫逃避过程中起到了一定作用.

弓形虫排泄/分泌抗原的免疫保护性研究进展

弓形虫排泄/分泌抗原(ESA)是虫体在黏附、侵入宿主细胞及在纳虫泡中寄生过程中分泌、排泄的抗原物质.近期的研究主要通过体外培养法获取ESA,并对其进行分子生物学及免疫学特性研究.ESA中的多种成分具有较强的免疫原性,可诱导细胞及体液免疫应答并产生抗弓形虫感染的保护作用.研究ESA的免疫保护作用对揭示弓形虫带虫免疫及免疫逃避机制有重要意义,对弓形虫病的诊断及免疫预防、疫苗候选抗原的制备具有重要价值.

寄生虫排泄分泌抗原的保护性及在疫苗研制中的作用

本文介绍了近年来国外学者对寄生虫排泄分泌抗原(ES抗原)的保护性及其在疫苗研制中的作用.

排泄分泌抗原以ELISA法用于华支睾吸虫病血清学诊断优于粗抗原

弓形虫ESA诱导小鼠产生的CD8+T细胞对早期黑色素瘤生长的影响

目的 观察弓形虫排泄分泌抗原(TgESA)对B16F10黑色素瘤接种小鼠CD8+T细胞的影响,以及CD8+T细胞对B16F10黑色素瘤的作用.方法 取RH株弓形虫速殖子体外培养12h后,收集培养液,离心取上清,获得弓形虫ESA.15只C57BL/6小鼠随机分为A、B和C 三组(每组5只).B组和C组每鼠右腋窝皮下接种B16F10黑色素瘤细胞2×105个,A组注射等量无菌PBS.接种后第7天,C组每只小鼠腹腔注射TgESA 100μl.接种后第13天,处死小鼠,无菌取脾.流式细胞仪检测各组小鼠CD3+CD8+T细胞所占脾细胞比例;采用免疫磁珠分选B组和C组脾细胞中的CD8+T细胞,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测两组CD8+T细胞对B16F10细胞的杀伤作用,分别设效靶细胞比为2.5∶1、5∶1和10∶1.另取30只C57BL/6小鼠随机分为E、F和G三组(每组10只),每鼠接种B16F10细胞2×105个.接种同时,F组和G组小鼠分别尾静脉注射分离自B组和C组的CD8+T细胞(2×105个/鼠).观察小鼠瘤体生长情况,记录各组小鼠死亡数和死亡时间,共观察35 d.结果 流式细胞仪检测结果显示,A、B和C组脾脏CD3+CD8+T细胞占脾细胞的比例分别为(13.86±0.13)％、(14.18±0.27)％和(15.74±0.28)％,C组显著高于其他两组(P＜0.05).LDH释放试验结果显示,不同效靶细胞比时,C组的CD8+T细胞杀伤活性均显著高于B组(均P＜0.05).G组的平均出瘤时间[(14.9±1.2)d]晚于F组[(11.9±0.7)d]和E组[(9.4±1.2)d] (P＜0.05).3组小鼠自出瘤后瘤体均不断增长,但增长速度无明显差异,G组的瘤体面积始终小于其他两组(均P＜0.05).E、F和G组小鼠分别于B16F10细胞接种后第26、29和30天开始出现死亡,至观察终点(第35天),3组小鼠存活的数量分别为3、5和7只.结论 TgESA可上调B16F10黑色素瘤小鼠CD8+T细胞的数量和杀伤功能,上调的CD8+T细胞具有早期延缓肿瘤生长的作用.

旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中特异性诊断抗原的研究

目的寻找旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)物中的特异性诊断抗原.方法应用SDS-PAGE和Westem印迹对旋毛虫肌幼虫体外培养18、30 h后的ES抗原中的蛋白组分进行研究.结果旋毛虫肌幼虫培养18、30 h后得到的ES抗原组分大致相同,两种ES抗原中主要蛋白带的分子量为112、110、108、97、53、49、45、42、35、23和16 kDa.18h ES抗原中的102、97、95和53 kDa以及30 h ES抗原中的53、49、45和43 kDa均与并殖吸虫病、华支睾吸虫病、日本血吸虫病及囊尾蚴病患者血清发生明显的交叉反应.ES抗原中的23 kDa蛋白组分只与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清反应,而不与上述其它寄生虫感染者、正常大鼠和小鼠及正常人血清发生交叉反应.结论旋毛虫肌幼虫ES抗原中的23 kDa蛋白组分为旋毛虫肌幼虫的特异性抗原,可用于旋毛虫病的血清学诊断及血清流行病学调查.

旋毛虫感染兔唾液中抗旋毛虫IgG抗体水平

将28只日本大耳兔随机分为实验组(20只)和对照组(8只),实验组用旋毛虫脱囊幼虫经口灌胃日本大耳兔(3 000条/只),对照组不做任何处理.采集感染前和感染后1～6周兔唾液和血清以及对照组兔唾液和血清.建立旋毛虫肌肉幼虫排泄分泌抗原(MLESA)为诊断抗原的间接ELISA,测定兔唾液和血清中抗旋毛虫IgG抗体.结果 显示,感染后1～6周,唾液阳性率分别为10%、15%、40%、65%、85%和95%;血清阳性率分别为35%、50%、80%、90%、100%和100%.感染后1～3周,唾液阳性率与血清阳性率差异有统计学意义(χ2=3.58、5.23、6.67, P＜0.05),感染后4～6周,两者差异无统计学差异(χ2=0.12、1.03、1.03,P＞0.05).提示在血清标本采集困难的情况下,MLESA的间接ELISA法检测唾液中抗旋毛虫IgG抗体可作为旋毛虫病免疫诊断的辅助方法.

弓形虫排泄分泌抗原对B16F10黑素瘤小鼠CD4+CD25+F0xP3+T细胞和NK细胞的影响

目的 探讨弓形虫排泄分泌抗原(ESA)对B16FI0黑素瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞数量和功能的影响,观察ESA对肿瘤生长的作用.方法 将传代培养的B16F10黑素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠右腋窝皮下,建立荷瘤动物模型.采用ESA腹腔注射进行干预,将实验小鼠分为4组:PBS组、B16F10组、PBS+ESA组、B16F10+ESA组,分别于ESA干预后2、4、6 d取脾,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞和NK细胞占脾细胞的比例;WST-8法检测各组小鼠CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25 T细胞增殖的抑制功能;LDH法检测NK细胞杀伤B16F10功能;观测荷瘤鼠肿瘤体积动态变化.结果 ESA干预4、6 d后,荷瘤鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞占脾细胞的比例分别为(1.65±0.18)%和(1.56±0.17)%,与荷瘤对照组[分别为(2.47±0.10)%和(2.82±0.12)%]比较差异均有统计学意义(P均＜0.05);ESA干预可使CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制功能下降.抑制作用以干预后4、6 d较明显,抑制率分别为50.03%和50.00%,低于荷瘤对照组的75.03%和78.14%(P均＜0.05);荷瘤鼠脾脏NK细胞占脾细胞的比例[(3.58±0.07)%]在ESA干预后6 d显著高于荷瘤对照组的(2.61±0.13)%(P＜0.05).同时NK细胞杀伤B16F10细胞功能也增强,不同效靶细胞比(5:1、10:1、20:1)下分别为26.51%、35.25%、60.19%,明显高于荷瘤对照组的16.81%、24.63%、45.62%(P均＜0.05);ESA干预后,瘤体出现延缓生长,平均出瘤时间较对照组延迟6 d,实验终点荷瘤第35天ESA干预组瘤体体积[(6 208.34±443.64)mm3]明显小于荷瘤对照组[(9027.46±1 362.01)mm3](P＜0.05).结论 弓形虫ESA可通过下调荷瘤鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例并抑制其功能和上调NK细胞比例并增强其杀伤功能,发挥抗肿瘤作用.