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应用免疫蛋白质组学方法鉴定弓形虫病诊断抗原分子的研究
目的 鉴定对弓形虫感染具有潜在诊断价值的弓形虫抗原分子.方法 制备刚地弓形虫RH株速殖子全虫可溶性蛋白及弓形虫感染小鼠腹腔蛋白,经SDS-PAGE分离后采用半干电转移方法将其转移到硝酸纤维素膜上,再分别与22份弓形虫感染者血清进行Western blot,以22份健康人血清和其他寄生虫病患者血清作为对照,筛选能被弓形虫感染者血清特异性识别的蛋白组分;两种蛋白样本经二维电泳分离后采用Western blot筛选能被弓形虫感染者混合血清识别,但不能被健康人血清及其他寄生虫病患者血清识别的特异性斑点.切取SDS-PAGE胶上相应的特异性蛋白质斑点进行MALDI-TOF分析,鉴定蛋白斑点的基因.结果 一维电泳及Western blot结果显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的90、37、30、28和18 ku组分分别可被部分弓形虫感染者血清识别,其中为28 ku蛋白能被22份弓形虫感染病人血清中的15份所识别;速殖子全虫可溶性虫体蛋白中的90、70、67、56、48、39、37、30、28和18 ku组分可被部分弓形虫感染者血清识别,其中28 ku蛋白可被22份弓形虫感染者血清中的21份识别,22份健康人血清中有2份与28 ku蛋白呈弱阳性反应,与其他寄生虫病患者血清无交叉反应.二维电泳Western blot阳性斑点的飞行质谱分析显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的28 ku组分为磷酸丙糖异构酶,弓形虫速殖子全虫可溶性蛋白中的28 ku组分为GRA2和GRA7.结论 弓形虫抗原与宿主抗体反应具有高度异质性,GRA2、GRA7及磷酸丙糖异构酶等分子的弓形虫感染者血清识别率高,此三种蛋白可作为建立具有高敏感性的弓形虫病特异性免疫诊断方法的抗原分子.
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弓形虫三磷酸核苷水解酶-II的克隆、表达及初步应用
目的 探讨弓形虫RH株速殖子NTPase-II重组蛋白的免疫反应性及其在抗体检测中的应用.方法 通过PCR获得NTPase-II基因,克隆入pGEM-T Easy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中以包涵体形式获得高效表达.SDS-PAGE和Western-blot分析蛋白表达产物.用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步建立检测抗NTPase-II抗体的间接ELISA方法.结果 PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase-II基因序列,经测序鉴定无基因突变.重组质粒诱导表达产物相对分子量约70kD,与理论值相符.经Western-blot证实,重组蛋白可刺激机体产生相应的抗体.具有良好的抗原性和免疫原性.用表达的重组NTPase-II蛋白初步建立了用于NTPase-II抗体检测的间接ELISA方法.结论 重组NTPase-II蛋白具有较强免疫原性,可作为诊断抗原用于急性弓形虫感染诊断试剂的研发.
关键词： 弓形虫RH株 速殖子 三磷酸核苷水解酶-II 原核表达 间接ELISA -
RNA原位杂交法检测组织内弓形虫的实验研究
目的探讨RNA原位杂交法在弓形虫病理检测中的应用.方法设计并合成弓形虫SAG2基因来源的寡核苷酸探针.弓形虫RH株感染昆明株小鼠,分别于感染后第2、3、4、5、6、7天处死,取肝组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交,结果同HE染色及免疫组化相比较.结果 RNA原位杂交法于感染后第2天检到阳性结果,组织内弓形虫的检出率(28/28)高于免疫组化(21/28)及HE染色法(16/28).结论 RNA原位杂交法是一种简便准确的弓形虫病理检测方法.
