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建立基于循环肿瘤细胞上的RNA原位杂交技术
目的:循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是一种重要的体液生物标志,通过检测CTC的数量及其表型可以动态了解肿瘤进展.本研究建立一种基于CTC细胞滴片上的RNA原位杂交方法,分析CTC表型间接了解肿瘤进展.方法:采用负性富集技术获得肝细胞肝癌患者外周血CTC等有核细胞的细胞滴片,并在CTC滴片上尝试建立RNA原位杂交技术.选择真核生物高度保守的肽基脯氨酰顺反异构酶B(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B,PPIB)基因作为阳性对照,合成针对PPIB基因高灵敏度的RNA杂交探针,并在实体肿瘤患者外周血CTC滴片中检测PPIB基因的转录活性.结果:用于外周血有核细胞负性富集的多种试剂,均不影响在CTC滴片上的RNA原位杂交,终优化了对传统CTC滴片细胞的固定方式和固定时间,实现了在负性富集的肝细胞肝癌CTC滴片上的PPIB基因原位RNA杂交,获得了CTC细胞中PPIB基因转录信息,建立了实时动态监测实体肿瘤患者外周血CTC中特定基因转录活性的方法.结论:缩短采血到固定细胞的时间以减少RNA降解,通过高灵敏探针的RNA原位杂交可以实现对CTC中特定基因转录水平的实时监测.
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使用组织微阵列对浸润性膀胱癌癌基因的研究
目的:比较基因杂交(CGH)研究发现染色体5p扩增与膀胱癌的发展有关;TRIO基因位于扩增区,其编码的蛋白在细胞周期调节中起主导作用.本研究在于了解TRIO的扩增和表达是否与膀胱癌的发展有关.方法:荧光原位杂交(FISH)、RNA原位杂交、Northern Blot分析.结果:微小组织微阵列(TMA)FISH显示:12/14例膀胱癌组织显示TRIO扩增;含有1 636例膀胱癌的组织微阵列FISH研究发现TRIO扩增与肿瘤浸润表现型、低分化密切相关.TRIO扩增仅见于1.5%早期膀胱肿瘤(pTaG1/G2)(7/456例),而在膀胱癌(pT1～4)高达12.8%(62/485例).RNA原位杂交和Northern Blot法证实TRIO在膀胱癌组织高表达.结论:TRIO扩增和高表达常发生在浸润性生长膀胱癌(pT1～4),可能在膀胱癌的发展过程中发挥重要作用.
关键词： 膀胱肿瘤 FISH RNA原位杂交 Northern Blot法 组织微阵列 -
TRIO扩增和高表达在膀胱癌的进展和癌细胞快速生长中的作用
目的比较基因杂交(CGH)研究发现染色体5p扩增与膀胱癌的进展有关;TRIO基因位于扩增区,其编码的蛋白在细胞周期调节中起主导作用.本研究在于了解TRIO的扩增和表达是否与膀胱癌的发展有关.方法用原位杂交法(FISH)分析位于5p15.31～5p15.1上的7个基因(TAS2R1,ADCY2,DNAH5,CTNND2,TRIO,ANKH和MYO10)在膀胱癌组织微阵列的作用,其中扩增率高的是TRIO基因.含有2 317例膀胱癌的大组织微阵列进一步调查TRIO的扩增情况;RNA原位杂交法和Northern Blot法进一步了解TRIO在膀胱癌组织的表达情况.结果显示TRIO扩增与肿瘤分期、分化程度和肿瘤细胞快速增殖密切相关.TRIO扩增仅见于7例/456例早期膀胱肿瘤(pTaG1/G2)(1.5%),而在膀胱癌(pT1-4)高达62例/485例(12.8%).膀胱肿瘤组织微阵列RNA原位杂交法和Northern Blot法证实TRIO在膀胱癌组织高表达.结论TRIO扩增和高表达可能在膀胱癌的发展过程中发挥重要作用.
关键词： 膀胱癌 FISH RNA原位杂交 Northern Blot法 组织微阵列 -
RNA原位杂交法动态观察弓形虫速殖子对BALB/c小鼠小肠黏膜的黏附及侵入
目的 RNA原位杂交法观察弓形虫速殖子黏附和侵入小肠黏膜的部位及时间.方法 30只BALB/c小鼠随机分为两组,实验组(24只)每鼠灌胃感染2×104个弓形虫速殖子(悬于0.2ml PBS),对照组(6只)给予等量PBS.分别于感染后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h和8 h各处死实验组小鼠4只和对照组小鼠1只,取十二指肠、空肠和回肠标本制备石蜡切片,并作RNA原位杂交.光学显微镜观察原位杂交切片,随机选取50个视野,计数所有观察视野内的虫体总数并计算平均数.结果 侵入的弓形虫速殖子可位于小肠上皮细胞(吸收细胞、杯状细胞和内分泌细胞)的纹状缘、吸收细胞胞浆内或相邻吸收细胞问及周有层内.感染后15 min,黏附于空肠的速殖子数量(4.93±3.949)显著高于回肠(3.78±3.102)(P＜0.05);侵入空肠的速殖子数量(4.92±4.164)显著高于十二指肠(4.10±3.532)和回肠(3.68±3.301)(P＜0.05).随着感染后时间的延长,黏附于各肠段的速殖子数量逐渐减少,而侵入的数量逐渐增多.与感染后15 min相比,感染后8 h,黏附于十二指肠(2.32±3.039)、空肠(3.15±3.241)和回肠黏膜(2.59±3.028)的速殖子数量均显著减少(P＜0.05),而侵入十二指肠(8.92±8.955)、空肠(9.11±6.667)和同肠黏膜(9.15±10.192)的速殖子数量均显著增加(P＜0.05).结论 弓形虫速殖子对其所黏附的小肠上皮细胞无严格的选择性,但其侵入小肠的部位具有选择性,空肠为速殖子侵入的易感部位.
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RNA原位杂交法检测灌胃接种弓形虫速殖子小鼠体内虫体的早期动态分布
目的 观察经灌胃接种弓形虫RH株速殖子后,虫体在小鼠体内的早期动态分布. 方法 弓形虫RH株速殖子经灌胃接种BALB/c小鼠20只(2×104/只),用RNA原位杂交法观察感染后1、2、4、6和8 d小鼠的肠系膜淋巴结(MLN)、肝、脾、肺和脑组织内速殖子的数量及分布趋势.同时设PBS空白对照组(5只). 结果 感染后1 d,在MLN、肝和脾组织内均检测到速殖子,分别于感染后4 d和6 d在肺和脑组织内检测到速殖子.感染后6～8 d,各组织间虫荷差异均有统计学意义(P值均<0.05),组织内虫荷依次为MLN＞肝＞脾＞肺＞脑,各组织内虫体数量呈时间依赖性. 结论 弓形虫RH株速殖子经灌胃接种后,首先侵入MLN、肝和脾,其次为肺,后为脑,且虫体在MLN内增殖较快.
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RNA原位杂交法检测组织内弓形虫的实验研究
目的探讨RNA原位杂交法在弓形虫病理检测中的应用.方法设计并合成弓形虫SAG2基因来源的寡核苷酸探针.弓形虫RH株感染昆明株小鼠,分别于感染后第2、3、4、5、6、7天处死,取肝组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交,结果同HE染色及免疫组化相比较.结果 RNA原位杂交法于感染后第2天检到阳性结果,组织内弓形虫的检出率(28/28)高于免疫组化(21/28)及HE染色法(16/28).结论 RNA原位杂交法是一种简便准确的弓形虫病理检测方法.
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寡核苷酸探针RNA原位杂交法检测肺孢子虫的研究
目的 探讨RNA原位杂交法在肺孢子虫病理检测中的应用.方法 采用小亚单位RNA位点来源的寡核苷酸探针、地高辛加尾标记、Wistar雌性大鼠皮下注射地塞米松建立肺孢子虫肺炎动物模型,取肺组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交,并将结果与瑞氏-吉姆萨染色法进行比较.结果 RNA原位杂交法于感染后第3周检到虫体,呈游离分布;7～8周时检测到大量包囊；9～10周时滋养体大量出现；组织内肺孢子虫的检出率(32/32)高于瑞氏-吉姆萨染色法(25/32).结论 RNA原位杂交法是一种敏感特异的肺孢子虫病理检测方法.
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人肺癌中OPB7-1 cDNA片段的克隆定位
目的寻找肺腺癌发生及转移的相关基因,探讨肺癌发生发展的分子机理.方法应用细胞培养、逆转录-PCR、RH基因定位及RNA原位杂交方法研究确定肺癌相关基因.结果 OPB7-1 cDNA片段,经RH基因定位方法定位于1p31-1p34.在正常人肺cDNA文库、低转移能力肺腺癌细胞系AGZY83-a cDNA中存在的片段大小一致,但序列中存在个别碱基的差别.OPB7-1 cDNA片段(974 bp)与GenBank中已知序列同源性差,但与其有同源性的3个毗连群克隆均位于1号染色体上(1p31-1p34).24例临床病例分析发现,该片段在肺癌组织中均有不同程度的表达,在正常对照组织中未见明显表达,且在有淋巴结转移病例的肺癌组织中表达程度呈明显增高的趋势.结论提示OPB7-1可能为新的基因,与肺癌的发生、转移可能有一定的相关性.
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一种进行基因表达研究的有效技术--小鼠全胚胎RNA原位杂交
目的建立小鼠整体胚胎水平研究基因表达的方法. 方法采用地高辛配基标记的造血相关基因 Runx1和神经发生相关基因 Runx3 RNA探针,对10.5～14天小鼠全胚胎进行RNA原位杂交,通过检测胚胎组织中mRNA的存在状况来观察基因的表达. 结果在小鼠胚胎观察到 Runx1和 Runx3基因在不同组织中的清晰的杂交信号;不同探针和不同大小的胚胎需要不同的适蛋白酶K处理条件. 结论小鼠全胚胎RNA原位杂交技术是一种有效的研究基因表达的方法,可以从整体水平反映基因表达的全貌,在功能基因组学时代将具有很大的应用潜力,为基因表达研究提供了一种可与LacZ染色和免疫组织化学媲美的选择.蛋白酶K处理条件是否适当是小鼠全胚胎RNA原位杂交成功的关键因素.
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野生型p53基因在人肝癌细胞的表达及诱导其凋亡
目的: 探讨外源性野生型p53基因(wt-p53)对人源性肝癌细胞系生物学的影响.方法: 用脂质体转染法将真核表达质粒p53-pcDNA3转染人源性肝癌细胞系HepG2中, 用G418筛选细胞; 用生物素标记p53的cDNA探针, 通过RNA原位杂交方法, 检测p53-pcDNA3在细胞中的表达; 用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡指数.结果: G418筛选出了阳性转染细胞; RNA原位杂交显示HepG2的胞质成棕黄色, 证明了p53的表达; FCM检测表明, 转染p53-pcDNA3的HepG2细胞, 其增殖能力下降, 细胞凋亡指数由转染前的10.03%上升为54.17%.结论: 外源性wt-p53可通过脂质体转染法在HepG2细胞中成功表达, 并诱导其发生凋亡, 有较好的临床应用前景.
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新型循环肿瘤细胞计数与上皮/间质型探针标记技术在膀胱癌中的临床应用
目的 本研究旨在探索在膀胱肿瘤中,新型循环肿瘤细胞(CTC)计数技术与基于RNA原位杂交的上皮/间质型探针标记技术的临床应用价值,初步探索上皮-间质转化在循环肿瘤细胞的作用与膀胱肿瘤肌层浸润的关系.方法 本研究纳入2015年5月至10月我院诊治的膀胱癌患者(cT1～4aN0M0) 115名,同时纳入25名健康志愿者作为对照组.采用改良的CanPatrolTM法分离富集CTC,应用上皮型(Epi)探针(EpCAM、CK8/18/19)和间质型(Mes)探针(Twist、Vimentin)通过RNA原位杂交(RNAISH)对分离得到的CTC细胞进行EMT标记.结果 115名膀胱癌患者中93例(81％)患者为CTC阳性,健康志愿者共检测到CTC 0个(P＜0.001).对CTC进行RNA-ISH,发现肌层浸润型膀胱癌患者外周血CTC(P=0.049)、混合型CTC(P=0.018)及间质型CTC(P＜0.001)的检出阳性率显著高于非肌层浸润性膀胱癌.pT1患者外周血CTC(P＜0.001)、上皮型CTC(P=0.001)与混合型CTC(P＜0.001)显著高于pTa患者.结论 新型循环肿瘤细胞(CTC)计数与基于RNA原位杂交的上皮/间质型探针标记技术可较敏感的检测出膀胱癌患者循环肿瘤细胞.间质表型CTC可能与肿瘤肌层浸润相关,提示EMT与膀胱肿瘤肌层浸润可能存在相关性.
