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心脉通对家兔颈动脉内皮损伤后野生型p53基因表达的影响
目的:探讨中药复方制剂心脉通防治经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄作用机理.方法:用Fishman空气干燥法,建立家兔颈动脉内皮损伤模型,以组织原位杂交方法观察心脉通对家兔颈动脉内皮损伤后p53基因表达的影响.结果:术后3天出现表达,7天表达增强,14天表达高峰,21天表达减弱,28天仍然持续表达.其中A组(心脉通组)表达信号强,B组(华法令组)弱于A组,C组(手术对照组)显著弱于A、B组.结论:心脉通能促进家兔颈动脉内皮损伤后野生型p53基因高表达,这可能是心脉通防治再狭窄的重要机理之一.
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腺病毒介导的Wt-p53基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响
目的 探讨野生型p53(wt-p53)基因对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)增殖的影响.方法 通过腺病毒载体将wt-p53基因转染至KFB中,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测转染组与非转染组KFB中wt-p53的mRNA表达;通过间接免疫荧光法检测转染组与非转染组KFB中wt-P53蛋白表达;转染后1～6 d用台盼蓝染色法计数活细胞数,并绘制生长曲线;采用流式细胞仪检测两组细胞生长周期各时相分布.结果 两组细胞中wt-p53的mRNA表达相差明显,转染组细胞中wt-P53蛋白表达明显强于非转染组;转染组细胞G0～G1期比例明显高于非转染组(P＜0.05),而G2～M期比例明显低于非转染组(P＜0.05).结论 wt-p53基因能明显抑制体外培养的KFB增殖.
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热咸饮食对胃粘膜组织中p53基因表达的影响
慢性萎缩性胃炎属于癌前病变,它是胃癌发生的重要环节.建立简单可靠的萎缩性胃炎动物模型并且研究其发生机制,为胃癌及癌前病变的发生机制及对胃癌的预防提供新的依据,是胃癌癌前病变研究的重要课题.
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一氧化氮对肿瘤细胞辐射敏感性的影响具有G2/M期依赖性
目的 观察不同浓度一氧化氮对携带野生型p53基因状态的人肺腺癌细胞所在不同周期中生存、凋亡、染色体畸变和DNA双链断裂的双向性影响.方法 选择携带野生型p53基因的人肺腺癌细胞作为研究对象.急性X线照射(3 Gy、6 Gy)野生型p53基因的人肺腺癌细胞前6 h,使用不同浓度的一氧化氮(5μmol/L、500μmol/L)作用于细胞,或使用0.02 Gy小剂量预照射.使用血清饥饿方法获得细胞同步化,经过离心后收集有丝分裂的细胞,有丝分裂后分别培养2.5 h、12.5 h、17.5 h,依次获得G1、S、G2/M期细胞.细胞敏感性、细胞凋亡、染色体畸变和DNA双链断裂分别由克隆形成实验、TUNEL染色法、染色体显带技术和免疫荧光检测.结果 主要在G2/M期细胞,在急性大剂量辐射前,先给予小剂量0.02 Gy预照射,或使用一氧化氮供体硝酸异山梨酯(ISDN)浓度为5μmol/L,可明显观察到对于辐射的适应性反应,反应的主要外在表现为抑制细胞的凋亡,细胞内的染色体出现畸变或者DNA双链发生断裂的降低.另一方面,与之相反的是,也是在G2/M期细胞,在急性大剂量辐射前,使用高浓度的500μmol/L IS-DN处理,细胞会出现明显的增敏反应,产生辐射增敏后具体的外在表现为加速了细胞的凋亡,同样染色体发生畸变以及DNA的双链断裂得到增强.结论 携带野生型p53基因状态的人肺腺癌细胞在一氧化氮放射诱导下的细胞生存、凋亡、染色体畸变和DNA双链断裂的影响具有G2/M期依赖性.
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脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡
背景:在前期研究基础上,设想将基因电转染作为脉冲电场治疗恶性肿瘤的辅助方法.目的:探讨脉冲电场联合抑癌基因野生型p53基因诱导人宫颈癌hela细胞发生凋亡及相互作用.方法:采用空质粒及含有野生型p53的质粒转染Hela细胞得到Hela-vector、Hela-p53细胞,将Hela细胞、Hela-vector和Hela-p53细胞分别施加固定脉宽100 μs、频率1 Hz、脉冲数8个、电场强度为1 500 V/cm的脉冲电场处理.结果与结论:相同参数脉冲电场作用于各组细胞12 h后,MTT结果显示Hela-p53组细胞吸光度明显低于Hela组(P < 0.05);流式细胞仪及RT-PCR检测结果显示Hela-p53组的早期凋亡率和p53 mRNA表达较Hela组明显增加;Western bolt及激光共聚焦显微镜结果显示与Hela组比较,Hela-p53组细胞Bax蛋白表达明显上升,而Bcl-2蛋白则明显下降,Casepase-3相对荧光强度明显增强.表明野生型p53基因对宫颈癌Hela细胞生长有明显的抑制作用,野生型p53基因可以提高脉冲电场诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的作用.
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p53基因转移至移植心脏的安全性
背景:课题组前期实验表明野生型p53基因具有抑制移植心脏冠状动脉内膜增厚的作用.目的:研究腺病毒介导的野生型p53基因转移至移植心脏的安全性.方法:以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体建立大鼠腹腔异位心脏移植模型,在取出供心后,经供心冠状动脉分别注射携带野生型p53基因的重组腺病毒液、携带β-半乳糖酐酶基因的重组腺病毒液和生理盐水800 μL,4 ℃静置30 min后进行心脏移植.结果与结论:移植后 5 d,重组腺病毒液组的供心冠状动脉组织可见野生型P53蛋白的表达.移植后28 d,未见受体大鼠血液生化学指标异常和重要脏器的病理性改变,RT-PCR扩增未见腺病毒E1A区产物.说明在心脏移植中,将腺病毒介导的野生型p53基因转移至移植心脏是安全的.
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野生型p53基因脂质体转染细胞疫苗的制备
目的:制备具有治疗活性的野生型p53基因真核表达载体的细胞疫苗.方法:利用RT-PCR从人外周血淋巴细胞总mRNA中扩增出全长的野生型p53基因,将其克隆入TA克隆载体,经扩增后,将p53cDNA连入pCMV真核表达载体中.利用lipofectamine将其转染DU145细胞并通过免疫组化的方法检测其表达情况.结果:p53基因可在DU145细胞中稳定表达.结论:制备了可稳定表达于DU145细胞中的野生型p53基因细胞疫苗.
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野生型p53基因转移对心肌细胞形态的影响
目的:探讨腺病毒介导的野生型p53基因转移对心肌细胞形态的影响及p53基因用于心肌疾病基因治疗的可能性.方法:将腺病毒介导的野生型p53基因转入体外培养的乳兔心肌细胞,应用生化染色方法、Western blotting技术检测野生型p53基因的转染效率及其表达效果,采用相差显微镜、透射电镜等实验方法观察心肌细胞的形态学改变.结果:重组腺病毒载体有效地将p53基因转入心肌细胞中并使其得以表达;转入的p53基因可以导致心肌细胞收缩、体积变小、胞浆浓缩、核固缩、染色质边集等改变.结论:野生型p53基因转移可以影响心肌细胞的形态,并能导致细胞凋亡.
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野生型p53基因转移抑制兔心肌细胞生长的实验研究
目的探讨野生型p53基因转移对兔心肌细胞生长的抑制作用及p53基因用于心肌肥厚基因治疗的可能性.方法将腺病毒介导的野生型p53基因转入体外培养的乳兔心肌细胞,应用生化染色方法、Western blot杂交检测野生型p53基因的转染效率及表达结果,采用透射电镜、MTT增殖抑制实验(MTT)及流式细胞仪细胞周期分析方法研究野生型p53基因对细胞生长的抑制作用.结果重组腺病毒能有效地将野生型p53基因转入心肌细胞中,并且检测到p53基因表达;转入的p53基因导致心肌细胞收缩、体积变小;MTT结果显示,野生型p53基因能够抑制心肌细胞生长,且生长抑制率呈现时间和剂量依赖性;心肌细胞增殖周期结果显示,细胞G0-G1期DNA百分含量明显高于对照组,提示发生G1期阻滞.结论野生型p53基因能高效转染体外培养的心肌细胞,对心肌细胞生长有明显的抑制作用,其抑制作用的机理是由于野生型p53基因影响心肌细胞的增殖周期,以上结果为心肌肥厚的基因治疗提供了重要的实验依据.
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肺腺癌高、低转移细胞系Anip973、AGZY83-a中野生型p53基因过表达研究
目的探讨野生型p53基因及其表达产物p53蛋白在恶性肿瘤基因治疗中的作用.方法应用腺病毒为载体将野生型 p53基因转入高、低转移的肺癌细胞系Anip973、AGZY83-a,并且对各组转染细胞进行生长曲线、原位末端标记、Western-blotting等技术检测分析.结果野生型p53蛋白的过表达对上述肺腺癌细胞系均呈现出较强的生长抑制作用,野生型p53蛋白的过表达对高转移肺癌细胞系Anip973的抑制作用明显高于低转移细胞系AGZY83-a.结论外源性野生型p53基因的过表达,可以有效抑制上述肿瘤细胞的增殖,同时对高转移肺腺癌细胞系的抑制作用更加显著.
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p53基因导致心肌细胞凋亡及其机制探讨
目的探讨野生型p53基因与心肌细胞凋亡的关系及其可能的发生机制。方法把野生型p53基因重组腺病毒转入体外培养的心肌细胞中，采用流式细胞计数仪（FCM），透射电镜等实验方法检测细胞凋亡并分析其作用机制。结果重组腺病毒能有效地将p53基因转入心肌细胞中；转入的p53基因可以导致心肌细胞体积变小、胞浆浓缩、核固缩、染色质边集，引起细胞G1期阻滞。结论野生型p53基因可以导致心肌细胞凋亡，并能影响细胞周期。以上结果为进一步研究心肌疾病的发病机制及其治疗提供了重要的实验依据。
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氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53基因对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响
目的:探讨氧化铁磁性纳米颗粒介导野生型p53基因(wild type p53,wt-p53)对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP增殖抑制和凋亡诱导的作用.方法:氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53转染肺腺癌细胞A549/DDP作为实验组,以纳米颗粒介导空载体pcDNA3转染作为阴性对照组,脂质体介导wt-p53转染作阳性对照组.MTT法和绘制生长曲线观察基因转染对A549/DDP细胞增殖抑制作用,荧光显微镜、流式细胞术观察其对A549/DDP细胞诱导凋亡作用,RT-PCR检测其对A549/DDP细胞Bax mRNA表达的影响.结果:氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53对人肺腺癌细胞A549/DDP增殖有持续的抑制作用,而以脂质体介导wt-p53对增殖抑制作用持续时间短暂;纳米颗粒介导wt-p53对人肺腺癌细胞A549/DDP诱导凋亡作用明显强于以脂质体载体;同时介导wt-p53上调Bax mRNA表达水平的作用也明显强于以脂质体载体.结论:氧化铁磁性纳米颗粒介导wt-p53转染对人肺腺癌细胞A549/DDP有持续的增殖抑制和诱导凋亡的作用.
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3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氢)-呋喃酮对小鼠ras、wt-p53基因表达的影响
目的 研究3-氯-4-二氯甲基-5-羟基-2(5氢)-呋喃酮(3-chloro-4-dichloromethyl-5-hydroxy-2(5H)-furanone,MX)对小鼠多组织的ras与野生型p53基因(wt-p53)表达的影响,从基因水平探讨MX致癌的机制.方法 昆明种雄性成年小鼠,每天按21 mgMX/kg的剂量经腹腔注射染毒,连续6d,生理盐水作溶剂对照.末次染毒24h后处死.运用原位杂交技术检测MX对小鼠肝、肾和小肠组织的ras基因与wt-p53基因表达的影响.结果 MX染毒组小鼠的肝、肾和小肠的ras-mRNA表达水平(0.165±0.007,0.155±0.011,0.196±0.035)明显高于溶剂对照组(0.147±0.007,0.136±0.004,0.132±0.026),且差异有统计学意义(P＜0.05).wt-p53-mRNA表达水平在MX染毒组略为降低,但与溶剂对照组相比没有统计学意义.结论 MX可诱导小鼠肝、肾和小肠组织中ras基因转录活性增强,但未能诱导野生型p53基因的异常表达.
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P53、Rb、IGF-I、AT1B基因转移对血管新生内膜增殖的影响
目的观察和比较人野生型p53基因、Rb基因、反义IGF-I基因与大鼠反义AT1B基因对大鼠颈动脉损伤后新生内膜增殖的影响.方法通过病毒载体介导,将上述4种基因分别转导至大鼠球囊损伤的颈动脉再狭窄模型中,21 d后观察并比较其对新生内膜形成的影响.结果与对照组相比,p53基因、Rb基因治疗组及反义IGF-I基因治疗组的动脉血管新生内膜/中层面积比均显著降低(P<0.01);与AdVβgal组相比,反义AdVAT1B基因组的动脉血管新生内膜/中层面积比显著降低(P<0.01).而p53基因治疗组、Rb基因治疗组、反义IGF-I基因组及反义AdVAT1B基因组之间无显著性差异(P>0.05).结论上述4种基因对血管成形术后再狭窄可能均有一定的预防作用.
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外源性P53基因转染的人肝癌细胞化疗药物敏感性的研究
目的探讨外源性P53基因转染对人肝癌细胞系HepG-2化疗敏感性的影响.方法将人野生型P53基因表达载体导人HepG-2细胞中,经筛选和鉴定后,采用MTF法观察其对甲氨蝶呤(MTX)和足叶乙甙(VP16)作用后的HepG-2细胞生长抑制及凋亡的影响.结果外源性P53基因在转染细胞中有效表达.增强了MTX和VP16对HepG-2细胞生长抑制并促进了药物诱导的细胞凋亡.结论外源性P53基因能增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性.
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重组P53基因转染的肝癌细胞克隆株的建立及其生物学活性观察
人P53基因位于17号染色体短臂上(17p13.1),编码一个由393个氨基酸组成的核磷酸蛋白,有调控细胞的生长,维持基因组的稳定,其突变、缺失在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用.为进一步探讨野生型P53基因的抗肿瘤特性,我室采用分子克隆方法构建了重组野生型P53真核表达载体(pxT1-P53),用磷酸钙-DNA共沉淀法将其导入人肝癌HepG-2细胞内,通过标记基因NeOR筛选带外源P53基因的G418抗药性克隆,对G418抗药性克隆细胞的生长增殖和粘附能力进行观察.结果表明,导入野生型P53基因能使肝癌HepG-2细胞的生长增殖速度较对照细胞明显减慢,细胞粘附能力下降.提示野生型P53基因能抑制肝癌细胞的生长.本研究为肝癌的P53实验性基因治疗提供了一定的依据.
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多西他赛联合野生型p53对Hela细胞的抑制作用
目的 探讨多西他赛单用及与野生型p53基因联合应用对宫颈癌Hela细胞的抑制作用.方法 Hela细胞分两组培养,p53转染实验组(p53-Hela组)和空白对照组(Hela组),野生型p53基因表达用逆转录-多聚酶链反应鉴定.多西他赛作用于p53-Hela细胞及Hela细胞,24小时与48小时后形态学观察并使用活细胞计数试剂盒检测吸光度值OD450,计算细胞抑制率.结果 用逆转录-多聚酶链反应法检测到p53-Hela细胞的p53 mRNA表达,与对照组Hela细胞的p53 mRNA表达相比,差异有统计学意义(t=-17.504,P<0.01).多西他赛对p53-Hela及Hela细胞作用时,不同时间都有抑制作用(Fp53-Hela=53.500,P<0.01;FHela=430.225,P<0.01),该抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性.结论 多西他赛单独应用时可对宫颈癌Hela细胞产生抑制作用,与野生型p53基因联用时,其药物抑制作用增强.
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野生型p53基因在人肝癌细胞的表达及诱导其凋亡
目的: 探讨外源性野生型p53基因(wt-p53)对人源性肝癌细胞系生物学的影响.方法: 用脂质体转染法将真核表达质粒p53-pcDNA3转染人源性肝癌细胞系HepG2中, 用G418筛选细胞; 用生物素标记p53的cDNA探针, 通过RNA原位杂交方法, 检测p53-pcDNA3在细胞中的表达; 用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡指数.结果: G418筛选出了阳性转染细胞; RNA原位杂交显示HepG2的胞质成棕黄色, 证明了p53的表达; FCM检测表明, 转染p53-pcDNA3的HepG2细胞, 其增殖能力下降, 细胞凋亡指数由转染前的10.03%上升为54.17%.结论: 外源性wt-p53可通过脂质体转染法在HepG2细胞中成功表达, 并诱导其发生凋亡, 有较好的临床应用前景.
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野生型p53基因在人肝癌细胞的表达及诱导其凋亡
目的:探讨野生外源性野生型p53基因对人源性肝癌细胞系生物学的影响.方法:用p53抗体对HepG2细胞系进行免疫组化检测,以了解其是否存在p53的突变;用脂质体转染法将真核表达质粒p53-pcDNA3转染人源性肝癌细胞系HepG2,用G418筛选细胞;用生物素标记P53的cDNA探针,通过RNA原位杂交方法,检测p53-pcDNA3在细胞中的表达;用流式细胞术检测细胞的凋亡指数.结果:HepG2细胞核着色成棕褐色,说明HepG2细胞系存在p53的突变;G418筛选出了阳性转染细胞;RNA原位杂交显示肝癌细胞的胞浆染成棕黄色,证明p53在肝癌细胞内得到了表达;p53通过阻止细胞周期的进行,使肝癌细胞的增殖能力下降,细胞的生长抑制率达到53.94%,细胞的凋亡指数由转染前的10.03%上升为54.17%.结论:外源性wt-p53对肿瘤细胞的基因治疗可以降低肿瘤细胞增殖能力,有效的抑制肿瘤生长,为肿瘤治疗赢得时间.
