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补肾通脉方对胰岛素抵抗大鼠胰岛素信号转导的影响
目的:观察补肾通脉方对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗(IR)模型大鼠肌肉和脂肪组织中胰岛素刺激后的胰岛素受体(InsR)和胰岛素受体底物-1(IRS-1)酪氨酸磷酸化的影响.方法:雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组和治疗组,治疗组以纯中药制剂补肾通脉方进行干预;模型组和治疗组大鼠均用脂肪占总热卡含量61%的高脂饲料饲养8周,正常组喂以普通饲料;常规测定空腹血糖(FBG)及葡萄糖负荷后1、2h血糖(BG-1h, BG-2h),以放射免疫法测定空腹血清胰岛素(Fins);采用免疫沉淀及Western blot技术测其肌肉及脂肪组织中胰岛素刺激后的InsR和IRS-1酪氨酸磷酸化水平.结果:与模型组比较,治疗组FBG虽无明显变化,但Fins显著降低(P＜0.01),因而胰岛素敏感指数(ISI)明显升高(P＜0.01);治疗组BG-1h和BG-2h水平较模型组明显降低(P＜0.05,P＜0.01);治疗组大鼠肌肉和脂肪组织中InsR β亚单位和IRS-1酪氨酸磷酸化蛋白电泳条带密度明显增加.结论:补肾通脉方对大鼠IR有显著的改善作用,其机制可能与提高IR大鼠肌肉和脂肪组织中InsR和IRS-1在胰岛素刺激后的酪氨酸磷酸化水平,改善胰岛素信号转导等环节有关.
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病毒上清液促进体外培养INS-1细胞系胰岛素分泌
信号传导与转录激活因子(signal transducer and activitor of transcrrption,STATs)是一类通过酪氨酸磷酸化激活的转录因子家族.STAT5是这一家族的重要成员,有STAT5A和STAT5B两种异构体,两者具有高度同源性,它们可以在接受生长激素、催乳素、干扰素以及促红细胞生成素等多种激素或细胞因子刺激后,通过酪氨酸磷酸化偶联形成二聚体,获得进入细胞核的能力,影响目的基因的转录,从而广泛参与细胞的增殖和分化,调节细胞的凋亡.
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结核杆菌抗原活化的γδT细胞中ZAP-70的酪氨酸磷酸化特点
目的观察结核杆菌抗原(Mtb-Ag)活化的γδT细胞信号转导分子ZAP-70酪氨酸磷酸化的特点. 方法用Mtb-Ag和抗CD3单克隆抗体(CD3 McAb)体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC),诱导活化,在含IL-2的培养液中扩增培养,分别获得Mtb -Ag激活的T细胞(Mtb AT)和CD3 McAb激活的T细胞(CD3 AT).再分别用Mtb-Ag和CD3 McAb刺激,在不同时间内提取细胞裂解液,用抗-酪氨酸磷酸化蛋白抗体作免疫沉淀,用抗ZAP-70单克隆抗体进行免疫印迹. 结果 Mtb AT中γδT细胞可达60%～80%,CD3 AT中CD3+细胞可达90%以上,而γδT细胞＜10%;Mtb AT细胞用Mtb-Ag再刺激后15*!min时出现ZAP-70的酪氨酸磷酸化,30*!min达高峰,可持续到60～120*!min,而CD3 AT用CD3 McAb再刺激后仅在5*!min时检测到ZAP-70的磷酸化. 结论与CD3 McAb对普通T细胞的作用比较,Mtb-Ag刺激可优先活化γδT细胞,其对γδT细胞ZAP-70活化的特点是:较慢、较强、较持久.
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缬沙坦对肾性高血压大鼠心肌肥厚及富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶表达的影响
背景和目的 富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)是一种新发现且活跃的酪氨酸蛋白激酶,该酶能催化多种含SH同源域2的底物蛋白磷酸化,参与细胞的生长、增殖和分化.本文以肾性高血压大鼠(RHR)为模型,研究心肌中Pyk2的表达情况,探讨缬沙坦逆转左室重构的可能机制.方法 制备两肾一夹肾性高血压大鼠模型;将大鼠随机分为假手术组、模型组和缬沙坦组[术后第29天给予缬沙坦30 mg/(kg·d)];分别于术前及术后第1、4、8和12周测定动脉血压和心肌肥厚指数,用免疫印迹法检测心肌组织中Pyk2及其磷酸化表达.结果 术后4周已发生心肌肥大,8～12周心肌肥大进一步加重,缬沙坦能显著降低肾性高血压大鼠的血压,并能有效抑制心肌肥厚的形成(P＜0.01);术后大鼠心肌组织Pyk2活性逐渐增加(1周时,P＜0.05,4、8、12周时P＜0.01);缬沙坦降低Pyk2及其磷酸化表达水平,与同周龄模型组相比差异有非常显著意义(P＜0.01).结论 Pyk2及磷酸化在RHR心肌组织内表达增高,且与心肌肥厚相关;缬沙坦能下调Pyk2的表达和磷酸化变化.这可能是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂逆转心肌肥厚重构的机制之一.
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肝大部分切除或HGF刺激可以引起STAT3和TEC的同时激活
目的:了解STAT3和TEC在肝再生以及HGF刺激的肝干细胞中激活情况,探讨在肝细胞早期增生中STAT3和TEC的活化的相关性.方法:建立小鼠肝大部分切除和HGF刺激肝干细胞(WB F-344)的体内、体外两个试验模型,采用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)、免疫印迹(immunoblotting,IB)的方法检测TEC和STAT3酪氨酸磷酸化激活水平与时间,使用凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)分析核蛋白与STAT3 DNA特异序列的结合能力.结果:肝大部分切除和HGF刺激下STAT3和TEC的磷酸化水平均快速明显升高,肝大部分切除后10-20 min时二者激活水平均达到高,HGF刺激后10 minTEC激活水平高,30 min STAT3活化水平高.肝大部分切除或HGF刺激下10 min左右,核蛋白与STAT3 DNA特异序列的结合能力明显增强.结论:肝大部分切除和HGF刺激下STAT3和TEC均被快速激活,他们之间可能存在相互作用,共同影响肝细胞早期增生反应.
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酪氨酸的磷酸化及去磷酸化对心脏钾离子通道的调控
心脏钾离子通道是人体内广泛存在的、种类多、作用复杂的一类离子通道,并在人类心肌细胞动作电位的各个时程中发挥着重要的作用.近年来由于新兴技术如膜片钳技术、基因突变技术、分子克隆技术等诸多技术的运用和发展,人们对钾离子通道的基因表达、分子结构、生理病理作用及调控机制等方面都有了很深的认识,然而对蛋白磷酸化与去磷酸化对心脏钾离子通道的调控尤其是酪氨酸磷酸化和去磷酸化调控方面的研究却比较少,为此做一简单综述.
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水杨酸制剂或靶向破坏IKKβ逆转由肥胖及饮食引起的胰岛素抵抗
大剂量水杨酸制剂,包括水杨酸钠及阿斯匹林(Aspirin)治疗2型糖尿病的作用机制,及通过IKK复合物(包括IKKα、IKKβ、IKKγ)旁路调节胰岛素信号转导,从而逆转由肥胖及饮食引起的胰岛素抵抗的分子靶点的研究在动物实验中获得突破性进展.该研究用12周Zucker fa/fa大鼠及8周ob/ob小鼠,分别给予120mg/kg@d-1的Aspirin持续皮下注射3周,观察到空腹血糖及胰岛素水平下降,葡萄糖耐量(GTT)及胰岛素耐量(ITT)均明显改善,提示胰岛素敏感性提高,同时血浆甘油三酯及游离脂肪酸浓度下降,此剂量Aspirin并未引起肝损害,也不影响摄食及体重.分离Zucker大鼠的肝脏及肌肉组织以检测各种胰岛素信号蛋白,发现上述组织中胰岛素受体(IR)及胰岛素诱导的AKT蛋白激酶酪氨酸磷酸化活性增强,胰岛素受体底物1(IRS-1)电泳迁移率提高,显示负性信号转导的丝氨酸,苏氨酸磷酸化程度降低,提示胰岛素生物效应的增强.
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运动对胰岛素抵抗大鼠丝氨酸/酪氨酸磷酸化通路干预效应的研究
目的 观察运动对高脂膳食诱导胰岛素抵抗(IR)大鼠骨骼肌胰岛素受体底物1(IRS-1)丝氨酸307(Ser307)磷酸化和酪氨酸(Tyr)磷酸化通路的影响.方法 Wistar大鼠75只,分为正常对照(NC)组、高脂膳食(HF)组.10周后再将HF组分为高脂膳食运动(HFE)组和高脂膳食非运动(HFNE)组.以钳夹技术观察各组大鼠胰岛素敏感性(IS)变化,Western Blot法检测大鼠骨骼肌IRS-1 Ser307磷酸化和Tyr磷酸化水平.结果 (1) 10周后HF组葡萄糖输注率(GIR60～120)明显低于NC组;与NC组比较,HF组IRS-1 Tyr磷酸化水平降低,IRS-1 Ser307磷酸化水平升高(P均＜0.01).(2) 14周后HFE组GIR60～120明显高于HFNE组;与HFNE组比较,HFE组IRS-1 Tyr磷酸化水平升高,IRS-1 Ser307磷酸化水平降低(P均＜0.01).结论 运动干预改善IR大鼠IS,其机制可能与改善IRS-1 Ser307/Tyr异常磷酸化有关.
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酪氨酸磷酸化蛋白在伤口愈合原胶原基因表达中的作用
目的研究伤口愈合时成纤维细胞与纤维粘连蛋白黏附,以及黏附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白在成纤维细胞表达原胶原mRNA中的作用.方法采用RT-PCR、免疫印迹法分别检测伤口愈合时成纤维细胞原胶原mRNA表达的变化及黏附诱导的酪氨酸磷酸化蛋白,并观察阻断酪氨酸磷酸化后原胶原mRNA和酪氨酸磷酸化蛋白的变化.结果伤口愈合时成纤维细胞与纤维粘连蛋白黏附,可诱导98kd、65kd酪氨酸磷酸化蛋白生成,且原胶原proa1(Ⅰ)mRNA的表达显著增加;经酪氨酸激酶抑制后,原胶原proa1(Ⅰ)mRNA显著降低.结论成纤维细胞与纤维粘连蛋白黏附,在伤口愈合原胶原表达增加中具重要作用,由黏附诱导的酪氨酸磷酸化是其中的一个重要环节.
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睫状神经营养因子对面神经损伤修复大鼠面神经核内STAT3磷酸化的影响
目的探讨重组人睫状神经营养因子(ciliary neurotrophica factor,CNTF)对面神经损伤修复大鼠面神经核运动神经元STAT3活性的影响.方法成年大鼠面神经切断后行端端吻合,局部给予CNTF,以生理盐水为对照.术后7 d,运用抗磷酸化STAT3抗体做免疫印迹(immuobloting,IB)以检测面神经核抽提物STAT3的磷酸化变化.结果局部给予CNTF组大鼠面神经核内p-STAT含量较对照组高(P＜0.05).结论局部给予重组CNTF可增强面神经损伤修复大鼠面神经核内STAT3的磷酸化.
关键词： 睫状神经营养因子 面神经损伤 端端吻合 信号转导与转录激活子-3 酪氨酸磷酸化 -
力竭运动后大鼠脑皮质运动区谷氨酸受体NR2A蛋白含量及酪氨酸磷酸化水平的变化
目的:观察力竭运动前后大鼠脑皮质运动区NR2A蛋白含量及其自身酪氨酸磷酸化水平变化,分析二者之间的相关关系,为探讨中枢兴奋信号在运动中的传递机理以及运动性疲劳的中枢机制提供实验依据.方法:SD大鼠进行一次性力竭跑台运动.采用抗NR2A抗体和抗磷酸酪氨酸单抗以免疫沉淀法和免疫印迹法检测皮质运动区NR2A蛋白含量及酪氨酸磷酸化水平.结果:力竭运动后即刻,大鼠脑皮质运动区NR2A蛋白含量与安静组相比无显著性变化,运动后1小时与安静组和运动后即刻比较显著升高(P<0.05,P<0.01),运动后3小时NR2A蛋白含量下降,运动后恢复24小时大鼠脑皮质中NR2A蛋白含量显著低于安静组和运动后即刻组(P<0.01,P<0.05).NR2A酪氨酸磷酸化水平力竭运动后与对照组相比呈升高趋势但无显著性差异,NR2A酪氨酸磷酸化水平与NR2A蛋白含量变化无显著相关.结论:(1)大鼠在力竭运动后即刻及恢复期过程中,大脑皮质运动区NR2A蛋白含量变化表现为下降,上升,再下降,表明运动过程中NR2A蛋白含量变化具有较敏感的可调控性,力竭运动后即刻NR2A蛋白含量的下降可能是导致中枢抑制的一个因素.(2)NR2A酪氨酸磷酸化水平在力竭运动后呈升高趋势,可能有利于维持中枢的兴奋性,提示运动过程中NR蛋白含量的变化可能是多方面原因造成的,受体蛋白含量与受体活性之间可能存在较为复杂的关系.
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瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响
目的 观察瘦素对大鼠肝细胞瘦素受体蛋白、基因表达及酪氨酸磷酸化的影响.方法 分离、培养新生Sprague-Dawley大鼠肝脏细胞,与瘦素共同孵育12 h、24 h及36 h,提取蛋白后用Western blot法检测瘦素受体的蛋白水平的变化,用RTPCR法检测大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA水平,用免疫共沉淀法检测瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度.结果 大鼠肝细胞的瘦素受体的蛋白水平在与瘦素共同孵育12 h、24 h和36 h后与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达在孵育12 h后与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),孵育24 h及36 h后,与对照组及孵育12 h时相比,mRNA水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).经瘦素作用12 h后,对大鼠肝脏细胞瘦素受体酪氨酸磷酸化无显著影响(P＞0.05),但孵育24 h及36 h后,大鼠肝脏细胞瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度与对照组及瘦素作用12 h后相比均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 瘦素可促进大鼠肝细胞瘦素受体的mRNA表达并增强其酪氨酸磷酸化程度.
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香烟烟雾提取物对猪气道上皮细胞β-连环素及酪氨酸磷酸化的影响
据<中华医学杂志>2001年4月81卷第7期报道华中科技大学同济医院病理学教研室陈芳等教授,为观察香烟烟雾提取物(CSE)和酪氨酸激酶抑制剂(tyrophostin 25)对气道上皮细胞(AEC)酪氨酸磷化程度、细胞Src蛋白(c-Src)及β-连环素(β-cat)表达的影响,探讨细胞酪氨酸磷酸化程度及β-cat在吸烟致AEC损伤和修复中的作用及调控机制,体外培养猪AEC,将培养细胞分成3组:N组加无血清培养基,C组在无血清培养基上分别加CSE,CT组加tyrophostin 25及CSE.
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IL-13及其变异体在呼吸道平滑肌细胞内对STAT6信号转导途径的影响
大多数学者认为IL-13主要是在细胞外通过与细胞膜上的IL-13Rα1受体、IL-13Rα2受体结合.IL-13与IL-13Rα1结合后,促使IL-13Rα1与IL-4Rα形成二聚体,从而激活JAK,随后一系列的信号途径被激活,包括胰岛素受体酶作用物(IRS-1,和IRS-2)、信号转导与转录(STAT)家族.STAT-6的SH2位点与IL-4R链酪氨酸磷酸化的残基结合,旦结合,STAT-6被JAK.磷酸化,而从此受体上释出来,与其他磷酸化的STAT-6分子形成二聚体,转运至核中,诱导基因转录激活,从而发生一系列信号转导,促使嗜酸细胞聚集,钙离子通道被激活,支气管平滑肌增生、再构杯状细胞增生,粘粹分泌增加等.因此IL-13及其受体在哮喘的发生和发展中起着重要作用.
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p62dok在糖尿病大鼠脂肪细胞中的变化
p62dok是新近发现的一种信号分子，属酪氨酸激酶下游蛋白，在胰岛素和／或Pervanadate等刺激下可产生酪氨酸磷酸化，酪氨酸磷酸化后的p62dok可与p21ras GAP结合，因而推测p62dok可能参与Ras/MAP激酶径路的调节，在胰岛素信号转导中起着重要作用，与糖尿病尤其是Ⅱ型糖尿病的发生、发展有关。
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血管内皮细胞蛋白酪氨酸磷酸化在血管通透性调节中的作用
目的:检测血管内皮细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平对内皮屏障功能的影响.方法:利用荧光比率测定技术测定猪游离冠状微静脉的通透性.利用Western印迹法和重组抗磷酸酪氨酸多克隆抗体测定内皮细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平.结果:磷酸酪氨酸水解酶抑制剂苯砷化氧(PAO,浓度为0.1、1、10和100μmol/L)可呈剂量依赖性地增加微静脉的通透性,分别为给药前的149.42%±9.71%、166.36%±6.38%、195.20%±15.30%和219.28%±24.12%.酪氨酸激酶抑制剂damnacanthal则可明显减弱组胺或佛波酯醇(PMA)介导的血管高通透性反应.PAO和组胺及PMA都可明显增加培养的内皮细胞骨架蛋白(65kd)的酪氨酸磷酸化水平.结论:蛋白酪氨酸磷酸化在激动剂介导的微血管高通透性反应中起着重要作用.
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慢性乙型肝炎患者肝组织胰岛素受体底物2的表达及其酪氨酸磷酸化的研究
目的 观察慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织胰岛素受体底物2(IRS-2)的mRNA和蛋白表达及其酪氨酸磷酸化程度,探讨IRS-2在CHB患者胰岛素抵抗(IR)发生中的作用.方法 选择6例肝功能正常者(对照组)及18例CHB患者,CHB患者再按HOMA模型计算的胰岛素抵抗指数分为CHB非IR(＜2.69)组(10例)和CHB合并IR(＞2.69)组(8例).所有患者于术中及肝穿刺后留取肝组织,采用逆转录-聚合酶链反应检测IRS-2 mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹法检测IRS-2蛋白表达;采用免疫沉淀及增强化学发光法检测IRS-2酪氨酸磷酸化程度.结果 CHB非IR组肝组织IRS-2 mRNA(0.38±0.06)、蛋白(0.94±0.18)表达及酪氨酸磷酸化程度(0.78±0.09)较对照组(分别为0.45±0.11、0.99±0.20、1.00±0.23)有所降低,但差异无统计学意义(均P＞0.05);CHB合并IR组IRS-2mRNA(0.26±0.08)、蛋白(0.67±0.11)表达及酪氨酸磷酸化程度(0.63±0.14)均较对照组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 CHB合并IR患者肝组织IRS-2的mRNA和蛋白表达及酪氨酸磷酸化程度的降低可能是产生IR的机制之一.
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STI571诱导K562细胞凋亡机制研究
目的研究格列卫(Glivec,STI571)诱导P210BCR/ABL(+)K562细胞凋亡机制.方法采用Annexin-Ⅴ/PI双染实验、DNA的PI染色、碘化二己基恶碳菁(DiOC6[3])染色、2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色及DNA Ladder等方法测定凋亡细胞.利用Western blot实验分析K562细胞蛋白酪氨酸磷酸化水平,测定Bcl-XL、caspase-3蛋白的表达并分别测定线粒体及胞浆部分的细胞色素C(cyto C)蛋白.结果 STI571可诱导K562细胞凋亡,出现DNA亚二倍体凋亡峰及DNA Ladder,线粒体跨膜电位及活性氧物质降低, P210BCR/ABL酪氨酸磷酸化水平降低,Bcl-XL、蛋白减少,caspase-3蛋白前体活化降解出相对分子质量为20×103亚单位,胞浆部分出现cyto C,同时线粒体cyto C减少.结论 STI571可迅速使P210BCR/ABL酪氨酸磷酸化水平下降,线粒体cyto C胞浆转位介导的信号通路是STI571诱导K562细胞凋亡的途径之一,STI571是有效的基因靶向治疗剂.
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表达Y568F/Y570F双位点突变型人c-kit受体对小鼠FDCP-1细胞增殖特性的影响
我们选择来源于正常小鼠骨髓的一种典型的早期造血祖细胞FDCP-1作为细胞模型,通过对稳定表达野生型和Y568F/Y570F双位点突变型人c-kit受体的重组细胞株hc-kit/FDCP-1和hc-kitDM/FDCP-1生物学特性进行比较,研究hc-kit受体近膜区第568位和570位酪氨酸磷酸化对FDCP-1细胞增殖的影响.
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短期胰岛素刺激对HIT-T15细胞胰岛素原基因表达的影响
目的：探讨短期外源性胰岛素刺激对HIT-T15胰岛β细胞胰岛素原（PI）基因表达的影响及机制。方法 HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞随机分为4组：含1.4 mmol/L葡萄糖完全培养基组作为空白对照(LG组)，为抑制内源性胰岛素释放干扰以低糖联合硝苯地平作为条件对照（LGC组），在LGC基础上分别加0.5 U/L或5 U/L的外源性胰岛素作为实验组(分别为LINS组和HINS组)，分别在刺激后0、30、60、90、120 min以荧光定量PCR检测各组PI mRNA，免疫组化检测各组细胞胰岛素受体底物1（IRS1）酪氨酸磷酸化水平。结果（1）LINS组、HINS组细胞PI mRNA表达均上调，在刺激后60 min PI mRNA表达量达高峰。（2）实验组在刺激后30 min IRS1酪氨酸磷酸化水平较对照组明显增高，高、低浓度胰岛素组细胞酪氨酸磷酸化达高峰时间不同。（3）LG组和LGC组间PI mRNA表达及IRS1酪氨酸磷酸化水平无明显差异。结论短期外源性胰岛素能上调胰岛β细胞PI基因的表达，且高浓度的胰岛素较低浓度胰岛素作用强。PI表达调控与IRS1信号传导有关。
