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p53在苯并[a]芘诱导所致p21和细胞周期蛋白改变中的作用
目的 探讨在苯并[a]芘(B[a]P)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)中p53蛋白对p21、cyclin D1和CDK4蛋白间相互作用的影响.方法 向转染p53小干扰RNA(p53 siRNA)质粒的HELF细胞即p53-H细胞组、载体CMV的HELF细胞即HELF/CMV细胞组中分别加入2μmol/L B[a]P作用24 h,向p53化学抑制剂Pifithrin-α(PFT-α)组即HELF/CMV+ PFT-α细胞组中同时加入2μmol/L B[a]P和20 μmol/L PFT-α作用24 h,各组同时设立不做任何处理的对照组.用免疫印迹(Western blot)法检测细胞中p53、p53-ser20以及p21、cyclin D1和CDK4蛋白水平的变化,同时利用免疫沉淀方法分析p53蛋白对p21、cyclin D1以及CDK4蛋白间相互作用的影响.结果 利用PFT-α或p53 siRNA技术抑制p53蛋白后,B[a]P诱导的p53蛋白20位丝氨酸磷酸化水平和p21蛋白水平的增高受抑制,B[a]P诱导的cyclin D1水平的增加不受影响,CDK4的水平不受B[a]P的影响;免疫沉淀实验结果表明,B[a]P引起的p21和CDK4结合的增加受到抑制,B[a]P引起的p21与cyclin D1结合的增加不受影响,cyclin D1和CDK4的结合不受B[a]P的影响.结论 B[a]P通过p53-ser20影响人胚肺成纤维细胞p21和CDK4的结合.
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连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及相互关系研究
目的观察连接蛋白36和闭锁小带蛋白1在HeLa细胞的表达及探讨两者之间的相互关系.方法RT-PCR获得Cx36全长编码区基因片段,与PCR2.1TOPO克隆载体连接测序,亚克隆到pcDNA3真核表达载体,脂质体介导法转染HeLa细胞,G418抗性筛选阳性克隆,Western blotting,双标记免疫荧光和免疫沉淀分析HeLa细胞Cx36和ZO-1表达及关系.结果构建了重组真核表达载体Cx36-pcDNA3,转染的HeLa细胞获得稳定表达Cx36的克隆,Western blotting显示转染的HeLa细胞表达Cx36蛋白.双标记免疫荧光染色显示,HeLa细胞膜之间Cx36呈点状或线状表达,在Cx36表达部位也同样表达ZO-1.免疫沉淀显示细胞裂解液分别与抗ZO-1或抗Cx36抗体共沉淀,抗Cx36或抗ZO-1抗体进行免疫检测,前者在36kD有特异性Cx36蛋白带,后者在220kD处有ZO-1蛋白带.结论转染Cx36的HeLa细胞表达Cx36和ZO-1,两者共表达并且相互结合.
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RNA 的 m6A 甲基化受 microRNAs 调控并促进细胞多能性重编程
m6 A 是普遍存在于 mRNA 的转录后修饰，约50％的核糖核酸甲基化修饰为 m6 A，指腺苷酸上6位 C 上连的氨基中的一个H 被甲基取代。已有研究表明 m6 A 甲基化形成缺陷可以影响昼夜节律、细胞减数分裂和胚胎干细胞增殖从而参与各种病理生理过程，然而 m6 A 形成的调控和参与细胞重编程的机制尚不清楚。作者为了探究这一过程，对四种不同分化潜能的小鼠ESC（胚胎干细胞），iPSC（诱导多能干细胞），NSC（神经干细胞）和 Sertoli cell（睾丸支持细胞）使用 anti-m6 A 抗体免疫沉淀甲基化的 mRNA，再通过 RNA 测序得到全基因组甲基化富集分布图谱。基因注释（gene ontology，为基因参与的生物过程进行注释的数据库）分析表明在四种细胞类型中稳定表达的转录本中，m6 A 富集于介导基本生物过程如细胞周期（cell cycle），RNA加工（RNA processing）的转录本；而介导蛋白的合成和功能的转录本中 m6 A 分布少。对转录本中 m6 A 分布的位置进行分析，发现 m6 A 在编码区和翻译终止区的富集是保守的。通过对细胞特异的 m6 A 甲基化富集分析，发现 m6 A 多分布在四种细胞特异的标记基因，参与细胞特异的生物过程如细胞干性维持和发育调控。
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP257抗α-干扰素机制初步探讨
目的 筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶N端257个氨基酸(TP257)相结合的抗α-干扰索(IFN-α)相关性肝细胞蛋白,初步探讨TP257抗IFN-α作用机制.方法 构建TP257腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-TP257,并与腺病毒骨架载体pADEasy-1重组,以293A细胞包装重组腺病毒.用重组腺病毒感染Huh7细胞并以IFN-α诱导,收获细胞蛋白,Western blot验证TP257蛋白在细胞中的表达.细胞蛋白进行免疫沉淀,SDS-PAGE分离后通过质谱鉴定差异蛋白.结果 构建的重组腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7细胞并大量表达TP257蛋白.Huh7细胞感染AD-TP257后以IFN-α处理,并通过免疫沉淀筛选到4种差异蛋白,其中3种经肽质量指纹图谱鉴定分别为热休克蛋白60、组蛋白HIST1H2BC和肌凝蛋白调节轻链12A.结论 TP257抗IFN-α效应可能与它和特定肝细胞蛋白结合并相互作用有关.
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Cpn0147基因真核表达载体的构建及在HeLa细胞中的表达
目的 构建肺炎衣原体Cpn 0147基因真核表达重组质粒,为进一步研究其与宿主相互作用的分子机制打下基础. 方法 以Cpn AR39株基因组为模板,以Cpn0147全长编码特异性引物进行PCR扩增;将Cpn0147基因插入至pcDNA3.1 +/His/Myc载体,构建pcDNA3.1+ /His/Myc Cpn0147重组质粒,经双酶切及测序鉴定后转染至HeLa细胞中,采用RT-PCR检测重组质粒转染情况,采用免疫荧光法及Western blot检测Cpn0147蛋白在细胞中的表达.试验设pcDNA3.1 +/His/Myc载体为阴性对照. 结果 从CpnAR39株基因组DNA中扩增出Cpn0147基因片段,大小466 bp,经双酶切、连接、转化、筛选,得到pcDNA3.1 +/His/Myc-Cpn0147重组质粒,序列测定证实与GenBank CpnAR39株Cpn0147基因序列一致;RT-PCR扩增出Cpn0147基因,与理论大小一致;免疫荧光检测重组质粒转染后HeLa细胞胞浆观察到红色荧光,对照组无荧光;Western blot检测到特异反应条带位于16 kd,对照组无此条带. 结论 成功构建pcDNA3.1 +/His/Myc-Cpn0147重组质粒并在真核细胞内表达Cpn0147蛋白,为进一步研究其分子生物学功能奠定了基础.
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肝大部分切除或HGF刺激可以引起STAT3和TEC的同时激活
目的:了解STAT3和TEC在肝再生以及HGF刺激的肝干细胞中激活情况,探讨在肝细胞早期增生中STAT3和TEC的活化的相关性.方法:建立小鼠肝大部分切除和HGF刺激肝干细胞(WB F-344)的体内、体外两个试验模型,采用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)、免疫印迹(immunoblotting,IB)的方法检测TEC和STAT3酪氨酸磷酸化激活水平与时间,使用凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)分析核蛋白与STAT3 DNA特异序列的结合能力.结果:肝大部分切除和HGF刺激下STAT3和TEC的磷酸化水平均快速明显升高,肝大部分切除后10-20 min时二者激活水平均达到高,HGF刺激后10 minTEC激活水平高,30 min STAT3活化水平高.肝大部分切除或HGF刺激下10 min左右,核蛋白与STAT3 DNA特异序列的结合能力明显增强.结论:肝大部分切除和HGF刺激下STAT3和TEC均被快速激活,他们之间可能存在相互作用,共同影响肝细胞早期增生反应.
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人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体
目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中.在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见乙型肝炎病毒S基因和核心基因表达.转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量.结论:人为截断HCV 5'NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础.
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小儿肺炎支原体感染的神经系统损害
近三十年,从流行病学和临床观察,采用敏感的诊断技术显示,城市人群中肺炎支原体感染很为常见.Hornsleth等人应用补体-固定抗体测定,6～11个月婴儿42%血清抗体阳性,1～9岁抗体阳性率为67%.Brunner等应用敏感的放射免疫沉淀试验检测血清抗体, 25～60个月婴幼儿67%阳性,97%的17岁及以上人群抗体阳性[1].
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小鼠局灶性脑缺血模型中细胞间粘附分子-1表达升高
目的白细胞可以导致缺血细胞损伤,内皮细胞上表达的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)有利于白细胞迁移至组织.本研究目的是对小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)后脑内ICAM-1蛋白在组织中表达和含量进行检测.方法通过对成年雄性CD-1小鼠使用血管腔内尼龙线栓塞术,造成0、3、6、12、24、48和72 h的持续性大脑中动脉栓塞.缺血程度由激光多普勒流量仪确定,缺血脑组织ICAM-1的阳性表达由免疫组化技术检测,并用免疫沉淀和Western印迹来定量.结果在大脑中动脉栓塞后,小鼠缺血脑半球的表面脑血流量减少到基准值的9%～15%.各组间大脑中动脉栓塞过程中的脑血流量无显著差异.免疫组化技术显示,缺血中心区和末影区都见ICAM-1阳性的微血管内皮细胞,从缺血中心到缺血边缘区微血管内皮细胞表达ICAM-1出现增高的趋势.免疫沉淀和Western印迹分析结果表明,缺血区ICAM-1的表达在大脑中动脉栓塞后3 h增高,6～12 h达到高峰,并持续到72 h.结论研究表明,在持续性大脑中动脉栓塞的小鼠中检测到ICAM-1表达明显升高,因为在持续局灶性大脑中动脉缺血后ICAM-1可介导白细胞和内皮细胞粘附,加速白细胞的浸润,提示ICAM-1是造成缺血脑损伤和引起脑卒中病因中的重要因素之一.
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曲匹地尔对培养大鼠血管平滑肌细胞的有丝分裂素激活蛋白激酶(MAPK)和P34cdc2激酶的影响
目的:研究曲匹地尔(Tra)对培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的细胞增殖周期及对有丝分裂素激活蛋白激酶(MAPK)和P34cdc2激酶的表达及活性的影响.方法:以流式细胞术测定细胞周期,免疫印迹法测定MAPK和P34cdc2的表达,免疫沉淀后测定MAPK和P34cdc2对其特异性底物髓脂质碱性蛋白(MBP)和Histone H1的磷酸化活性.结果:Tra降低细胞周期中S期比例和细胞分裂增殖指数,能明显抑制给血清刺激后MAPK的表达和活性,明显抑制P34cdc2激酶活性而对其表达无明显影响.结论:Tra对细胞周期的影响与其抑制MAPK和P34cdc2激酶活性和MAPK的蛋白表达有关.
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亚硫酸钠对人正常二倍体肝细胞内二酰甘油酰基转移酶1和载脂蛋白E mRNA和蛋白表达的影响
目的 通过研究亚硫酸钠对人正常二倍体肝(HL-7702)细胞内二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)和载脂蛋白E(apoE)mRNA和蛋白表达的影响,探讨亚硫酸钠诱发肝细胞脂肪积累效应及作用途径.方法 将处于对数生长期的HL17702细胞株分别暴露于终浓度为0(阴性对照)、10、2.5、0.5、0.1 mmol/L的亚硫酸钠溶液,并设立阳性对照(1.0 mmol/L油酸)组.分别于染毒24、48 h时,采用油红O染色法观察肝细胞内脂滴沉积,采用免疫沉淀和Western Blot法检测细胞内apoE和DGAT1蛋白的表达水平,采用qRT-PCR法检测肝细胞内apoE和DGAT1mRNA的表达水平.结果 与阴性对照组比较,仅10 mmol/L亚硫酸钠染毒24h时HL-7702肝细胞内DGATlmRNA表达水平明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).与阴性对照组比较,染毒24h、48 h时,10 mmol/L亚硫酸钠染毒组HL-7702肝细胞内DGAT1蛋白表达水平以及各浓度亚硫酸钠染毒组HL-7702肝细胞内apoE蛋白表达水平均明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).阳性对照组可见明显的脂滴沉积,但亚硫酸钠染毒组均未见明显脂滴.结论 一定剂量的亚硫酸钠可引起肝细胞内DGAT1、apoE蛋白表达增高,导致肝细胞内甘油三酯分泌增加,从而引起肝细胞的脂肪蓄积.
关键词： 亚硫酸钠 载脂蛋白E 二酰甘油酰基转移酶1 免疫沉淀 -
磷酸化蛋白质(多肽)组学分析与筛查急性白血病特异性分子标志
目的 筛查与分析急性白血病特异性的磷酸化蛋白质或多肽.方法 对16例初治急性淋巴细胞白血病(ALL)和20例急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞行蛋白多肽抽提及纯化,采用免疫沉淀及结合高效液相质谱-串联质谱分析,筛查特异性分子标志物.结果 ①非受体型酪氨酸蛋白激酶家族的Fyn、Yes和Src等在急性白血病中广泛表达；②非受体型酪氨酸蛋白激酶家族的Abl/iso1、Abl,非受体型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的Bcr、JNK2、JNK2 iso2,结合器/支架类的Cas-L、Cbl、CrkL CENTD1( Centaurin deha1) ZO2,转录调节因子GFR-1及磷酸酯酶SHIP-2,这些磷酸化的蛋白见于Ph染色体阳性ALL,基本不表达于其他ALL;③Hck、Lyn和Fgr选择性地与AML相关(M3除外).结论 ALL和AML存在相对特异的磷酸化多肽,为急性白血病的诊断及治疗提供了潜在的分子靶位.
关键词： 白血病 磷酸化多肽 免疫沉淀 磷酸化蛋白质组 高效液相质谱-串联质谱 -
抗p53融合蛋白单克隆抗体的性质鉴定
目的:研制出能特异与p53结合的单克隆抗体, 使对p53的检测得到更为广泛的应用.方法:以原核表达的p53-GST融合蛋白为免疫原,常规方法作细胞融合 ,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)双筛和免疫组织化学(IHC)筛选,将能稳定分泌抗人p53单抗的杂交瘤细胞株的细胞上清(命名为M126)与常用p53进口单抗 PAB1801(ZYMED公司)作对比实验.结果:此单抗适用于ELISA、 IHC、免疫印迹及免疫沉淀等方面的研究,并且在一定程度上优于PAB1801.结论:新制备的单抗M126可考虑取代进口单抗PAB1801而用于p53的表达及突变研究.
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鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位与恒定链的细胞定位及相互关系研究
目的:研究鸡Ⅰ类抗原递呈分子亚单位和鸡恒定链的细胞定位及相互关系.方法:RT-PCR获得鸡MHCⅠ类分子α、β2m亚单位,并进一步构建了能表达红色和绿色荧光蛋白的α、β2m亚单位的真核表达载体,利用脂质体介导法与能表达增强型绿色荧光的Ii真核表达载体共转染COS-7细胞,荧光显微镜检测Ii与MHCⅠ亚单位的细胞定位,并通过免疫共沉淀进一步研究它们之间的相互关系.结果:GFP-Ii与MHCⅠα-RFP、MHCⅠβ2m-RFP在细胞中共表达后出现共定位现象,且共定位于细胞的内膜系统;免疫共沉淀结果显示,只有当GFP-Ii链与MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP三者共转染后,才可以检测到MHCⅠα-GFP、MHCⅠβ2m-GFP的表达.结论:鸡Ii与单个的MHCⅠα、MHCⅠβ2m亚单位不能有效结合,Ii只有与完整的Ⅰ类抗原递呈分子才能够形成复合体,且共定位于细胞的内膜系统.
关键词： 鸡 Ⅰ类抗原递呈分子亚单位 恒定链 共定位 免疫沉淀 -
血管紧张素Ⅱ1型受体--一种预防大肠埃希菌K1所致新生小鼠脑膜炎的新靶标
大肠埃希菌K1所致脑膜炎的发病率越来越高。随着抗生素耐药不断升级，治疗此致命疾病需替代方案。该研究筛选了美国国立卫生研究院（N I H ）收集的小分子库，鉴定替米沙坦为一种血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）阻断剂，可作为大肠埃希菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞（HBMEC）的强效抑制剂。免疫沉淀研究表明，AT1R与内皮细胞gp96相互作用，HBMEC中的AT1R是大肠埃希菌外膜蛋白A。将HBMEC用替米沙坦预处理或转染AT1R小干扰 RNA后，能降低蛋白激酶Cα的磷酸化，从而抵抗大肠埃希菌入侵。用替米沙坦可溶性衍生物处理已感染大肠埃希菌的新生小鼠，能预防脑膜炎发生，在大脑中抑制中性粒细胞浸润和神经胶质细胞迁移。因此，替米沙坦有潜力成为防止大肠埃希菌所致脑膜炎的替代治疗药物。
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白塞病相关新自身抗原的初步免疫学分析
为探讨白塞病是否存在特异性循环自身抗体,我们应用免疫印迹结合免疫沉淀技术对39例该病患者血清进行了初步筛查.结果发现,分别有8份(20.5%)、9份(23.1%)血清识别相对分子质量约为100 000、50 000的细胞内性质不明成分,其中4份标本(10.3%)与上述两种蛋白反应;在免疫沉淀分析中,15份血清(38.5%)可主要沉淀细胞中相对分子质量约为200 000、160 000、120 000、100 000的某些蛋白,部分免疫印迹阳性的血清其免疫沉淀分析也呈阳性结果.研究提示白塞病血清中可能存在作用于细胞内未知抗原的IgG型自身抗体,值得深人探索,以澄清靶抗原的性质,明确相应自身抗体对白塞病的特异性、血清学诊断价值及其可能的免疫致病机制.
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应用血清蛋白组学技术筛选鼻咽癌肿瘤抗原
目的: 应用血清蛋白组学技术优化肿瘤抗原筛选方法,筛选鼻咽癌肿瘤抗原.方法: 以免疫印迹技术筛选出含有特异性抗体的鼻咽癌患者血清,运用免疫沉淀技术对血清与鼻咽癌细胞株(CNE1)的裂解物进行处理以富集肿瘤抗原,正常人血清做对照,经凝胶电泳找出差异条带,通过质谱分析、数据库搜索和信息学分析鉴定差异蛋白.结果: 应用此方法找出存在于鼻咽癌样本中的明显差异条带1条,重复性较好,经鉴定该条带为膜结合IgM.结论: 采用上述方法筛选肿瘤抗原行之有效,可能成为肿瘤抗原筛选的一种简单、便捷、灵敏的有效方法,得到鼻咽癌候选抗原膜结合IgM.
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HepG2肝癌细胞STAT3与β-catenin形成复合物及其功能研究
目的研究STAT3与β-catenin信号转导途径的相互关系.方法利用细胞的免疫组化双色染色和蛋白免疫沉淀的方法探讨STAT3与β-catenin是否形成复合物.利用荧光素酶活性分析的方法研究STAT3与β-catenin功能上的相互影响.结果HepG2细胞中STAT3和β-catenin在位置上存在共同分布.STAT3与野生型、突变型的β-catenin均可在HepG2细胞中形成复合物.在研究复合物功能时发现,随着细胞密度的增加,STAT3与野生型β-catenin形成的复合物含量减少.但STAT3对β-catenin转录激活活性未发现明显的影响.结论STAT3与β-catenin形成复合物的结果表明STAT3信号途径与β-catenin信号途径之间很有可能存在着一定的内在联系,为今后进一步研究肝癌的发生机理提供了新的思路.
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雄激素对表皮生长因子受体表达和激活的影响
目的:检测表皮生长因子受体(EGFR)在雄激素依赖和非雄激素依赖的细胞株中的表达和激活并探讨雄激素对其影响. 方法:先用双氢睾酮(DHT)以不同时间处理雄激素依赖前列腺癌(PCa)细胞株LNCaP及非雄激素依赖人PCa细胞株DU-145、PC-3,然后采用Western 印迹方法检测EGFR的表达,采用免疫沉淀和Western 印迹法检测EGFR磷酸化水平,以测定雄激素对LNCaP的EGFR表达和激活的影响.结果:DHT可使LNCaP中EGFR的表达明显增强,在使用5 nmol/L DHT孵育24 h后明显,并显示EGFR的表达增加和被激活是同步的.在DU-145和PC-3中未见类似现象出现.结论:雄激素依赖的LNCaP的EGFR表达增加和被激活,这种作用是通过雄激素/雄激素受体信号转导途径.雄激素刺激PCa细胞增生的机制涉及EGF/EGFR的信号转导途径.
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β淀粉样肽22-35单克隆抗体的制备和应用
目的制备稳定分泌Aβ22-35单克隆抗体的杂交瘤细胞，以Aβ22-35单克隆抗体建立Aβ检测方法。方法以人工合成的Aβ22-35连接匙孔槭血蓝蛋白，免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合，制得能稳定分泌Aβ22-35单克隆抗体的杂交瘤细胞，采用Western blotting增强化学发光技术观察大鼠脑内Aβ含量。结果得到2株能稳定分泌Aβ22-35单克隆抗体的杂交瘤细胞，Aβ22-35单克隆抗体的Ig亚类为IgG3，青年组和老年组大鼠脑Aβ含量分别为9.8±2.8和13.36±2.65pmol/12mg脑组织。结论制备得到的Aβ22-35单克隆抗体特异性强，效价高，测得的老年大鼠脑Aβ含量显著高于青年大鼠。
关键词： Aβ22-35单克隆抗体 免疫沉淀 蛋白印迹增强化学发光
