首页 > 文献资料
-
加压素(4 -8)对大鼠脑内Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ自身磷酸化的影响
大鼠皮下注射加压素(AVP)(4-8)1 h后,大脑皮层中Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)自身磷酸化程度与对照组比较增高192%,P＜0.001;海马中增高40%,P＜0.05.CaMKⅡ的自身磷酸化程度依赖于Ca2+及CaM的浓度.在用抗CaMKⅡα单克隆抗体对给药1 h组样品和对照组样品进行免疫印迹检测时,发现皮下注射AVP(4-8)1 h后,大脑皮层中CaMKⅡa亚基的蛋白量没有明显差异.AVP(4-8)的拮抗剂ZDC(C)PR可以明显阻断AVP(4-8)的作用,表明AVP(4-8)刺激CaMKⅡ的活化是通过受体介导的信号转导过程.
-
肠道喂养和静脉营养对烧伤大鼠骨骼肌26S蛋白酶复合体及19S调节复合体作用的影响
旨在考察静脉营养和肠道营养对严重烫伤后大鼠骨骼肌26S蛋白酶复合体和19S调节复合体的作用,为临床营养支持途径提供理论依据.利用两种烧伤营养模型--肠道喂养和静脉营养,用免疫沉淀扣除法测定了30%体表皮肤全层烫伤大鼠骨骼肌中26S蛋白酶复合体及19S调节复合体的活性变化.
-
SIP1在人舌癌Tca8113细胞中的定位和融合蛋白表达鉴定的研究
目的 检测Smad相互作用蛋白1(SIP1)在人舌癌Tca8113细胞系中的定位及融合蛋白的表达鉴定.方法 PCR扩增SIP1编码序列的全长,克隆到pCMV-Flag-MAT-Tag 1载体.利用共聚焦激光扫描显微镜观察SIP1和SIP1-Flag在人舌癌Tca8113细胞系中定位,并将构建好的Flag标签SIP1(SIP1 -Flag)真核表达载体转染到人舌癌Tca8113细胞系中,提取蛋白进行Western blot检测,利用Flag标签抗体进行免疫沉淀纯化SIP1-Flag融合蛋白.结果 构建了SIP1-Flag真核表达载体.SIP1和SIP1-Flag融合蛋白主要定位于人舌癌Tca8113的细胞核中,Western blot检测到SIP1-Flag融合蛋白表达,且在人舌癌Tca8113细胞中成功纯化SIP1-Flag蛋白.结论 成功构建真核表达载体.SIP1和SIP1-Flag主要定位于细胞核,成功鉴定融合蛋白表达并纯化SIP1-Flag融合蛋白.
-
3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位
目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白.方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag 标签的真核表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位.使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白.结果:hPAK4 全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp.Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白.结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白.3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中.
-
CYP4A/20-HETE和eNOS活化有关的调节蛋白间的相互作用
目的 研究CYP4A/20-HETE和eNOS活化有关的调节蛋白间的相互作用.方法 培养新生牛肺动脉内皮细胞(PAECs),用免疫沉淀(IP)和免疫印迹(WB)对下列4组的CYP4A,eNOS及eNOS调节蛋白进行测定:对照组:PAECs培养皿中加入与20-HETE处理组体积相同的乙醇溶剂,作用10 min;20-HETE处理5 min组:PAECs培养皿中20-HETE的浓度为1×10-6 mol·L-1,作用5 min;20-HET处理10 min组:PAECs培养皿中20-HETE 的浓度为1×10-6 mol·L-1,作用10 min;VEGF处理10 min组:PAECs培养皿中VEGF的浓度为1×10-8 mol·L-1,作用10 min.结果 经20-HETE 处理后:肺动脉内皮细胞eNOS蛋白表达增加、phospho-eNOS(Ser1177)合成增加;用VEGF进行的上述实验结果与20-HETE相似;20-HETE促使Hsp、蛋白激酶B(Akt)与eNOS结合.结论 免疫沉淀和免疫印迹实验结果表明:CYP4A与eNOS在肺动脉内皮细胞相互结合;20-HETE通过促使Hsp、蛋白激酶B(Akt)与eNOS结合,使eNOS(Ser1177)磷酸化,增加NO释放,舒张血管;VEGF和20-HETE的作用相似.
关键词： 20-羟化二十碳四烯酸(20-HETE) 免疫沉淀 免疫印迹 -
副肿瘤性天疱疮的研究进展
副肿瘤性天疱疮(paraneoplastic pemphigus,PNP)是天疱疮的一个亚型,早由Anhalt等[1]1990年首次报道,PNP是发生于皮肤粘膜的大疱性糜烂性皮肤病伴随潜在的恶性肿瘤,一般为淋巴网状内皮系统起源如非何杰金氏淋巴瘤和淋巴细胞白血病[2].粘膜侵犯通常较重,疼痛明显,对治疗反应差.皮损为多形性,包括红斑、大疱、糜烂、丘疹鳞屑性发疹、多形红斑样皮损.免疫沉淀可检测到250、230、210、190kd片段.组织病理表皮细胞间棘层松解、角质形成细胞坏死和空泡界面皮炎.
-
骨肉瘤细胞中SORBS1的表达和定位
目的 构建人SORBS1真核表达载体并检测在骨肉瘤细胞内的表达及定位.方法 以GST-hSORBS1为模板,利用PCR扩增hSORBS1基因cDNA全长,并将其克隆至3*Flag标签的真核表达载体中.进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到骨肉瘤细胞MG-63中,提取蛋白进行Western blot检测.同时利用共聚焦激光显微镜观察3* Flag-hSORBS1在MG-63细胞中的定位,使用免疫沉淀的方法纯化hSORBS1蛋白.结果 hSORBS1基因cDNA全长成功构建到真核表达载体3*Flag中,Western blot检测到3*Flag-hSORBS1融合蛋白表达,且在骨肉瘤细胞MG-63中主要定位于细胞周边,并成功纯化hSORBS1蛋白.结论 成功构建3*Flag-hSORBS1真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达,并纯化hSORBS1蛋白.3*Flag-hSORBS1蛋白主要定位在细胞周边.
-
M5毒蕈碱乙酰胆碱受体参与药物成瘾的研究进展
M5受体是毒蕈碱乙酰胆碱受体家族的一个新成员,是毒蕈碱乙酰胆碱受体家族(M1-M5亚型)后一个被克隆出来的,属于G蛋白偶联受体.免疫沉淀和mRNA原位杂交实验表明M5受体在中枢神经系统中特定区域表达,包括海马、丘脑、黑质和中脑腹侧背盖区(VTA)部位)[1,2,3].可是和其他M受体比较,M5受体表达水平较低,在脑内占M1-M5受体总表达不到2%.近来,M5受体在一些外周组织和细胞中也检测到.
-
免疫胶体金技术在快速诊断中的应用
免疫胶体金技术的起源可追溯到1971年,Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察沙门菌.随后30年的发展,免疫胶体金标记技术的不断成熟使之已不仅广泛应用于电镜水平研究、光显微细胞化学、免疫沉淀及蛋白质染色技术上,并且被引进免疫诊断工业领域中,尤其是在医学检验的快速诊断方面显现出了巨大的前景.
-
使用交联剂DMP消除免疫沉淀非特异性条带
目的 消除免疫沉淀技术中免疫印迹检测到的非特异性条带,排除非特异性条带对研究蛋白质分子相互作用及磷酸化的干扰.方法 检测蛋白交联剂庚二亚氨酸二甲酯(DMP)交联抗体和载体基质的稳定性及交联效果;积极寻找和优化抗原析出条件,分离出免疫沉淀复合物中抗原成分;检测析出抗原特异性条带及磷酸化水平.结果 DMP有效地将抗体共价结合于载体基质,具有较好的稳定性和交联效果,其免疫沉淀中未检测到非特异性蛋白条带;与Laemmli缓冲液相比,甘氨酸可有效地一次性析出免疫沉淀中大部分抗原;经pH值调整后,析出抗原的浓度及磷酸化水平无明显变化.结论 交联剂DMP能有效地消除传统免疫沉淀技术中检测到的非特异性蛋白条带,且能应用于蛋白质磷酸化的检测.
-
利用可控表达Cyclin B1的单克隆细胞株寻找与Cyclin B1结合的蛋白
目的 利用已经构建好的四环素诱导细胞周期素B1 (Cyclin B1)表达的单克隆细胞株,探索可能与Cyclin B1相互作用的蛋白.方法 加入四环素的单克隆细胞株能表达带有Myc和His标签的Cyclin B1.将未诱导和用四环素诱导48 h的细胞裂解后,分别加入10μg Myc的单克隆抗体,用免疫沉淀法(immune precipitation,IP)沉淀可能和Cyclin B1相作用的蛋白,将蛋白混合物行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用考马斯亮蓝染色法和银染法明确差异蛋白,再用质谱(mass spectrometry,MASS)行蛋白鉴定.结果 用质谱鉴定出的蛋白有细胞周期素依赖蛋白激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1),细胞周期素依赖蛋白激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2),有丝分裂阻滞缺失样蛋白1(Mitotic arrest deficient-like protein 1,MAD1-like 1,MAD1L1)和热休克蛋白8(heat shock 70kD protein 8 isoform 1).结论 除Cyclin B1和CDK1直接相互作用外,Cyclin B1与CDK2、MAD1L1和热休克蛋白8都可能有直接或间接的相互作用.
-
不同反应条件对免疫沉淀分离膜蛋白的影响
目的:探讨不同条件对免疫沉淀方法分离纯化膜蛋白时的影响.方法:分别应用磷酸盐缓冲液(PBS)和溶膜缓冲液(合去垢剂)作为反应系统,单克隆抗体PD4与胃癌细胞系MGC803细胞膜溶液进行免疫沉淀反应以获得PD4相关抗原,用Western blot检测膜蛋白的得量.结果:分离纯化PD4相关抗原时,用CNBr-Sepharose 4B-PD4进行免疫沉淀效果优于Protein A Sepharose 4B;溶膜缓冲液作为反应系统效果优于磷酸盐缓冲液.结论:免疫沉淀纯化膜蛋白时,应用抗体直接交联于Sepharose 4B和溶膜缓冲液作为反应系统效果更佳.
-
肌醇磷酯-3激酶介导血管紧张素Ⅱ激活血管平滑肌细胞系裂素活化的蛋白激酶
作者以前的研究显示血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)通过Ras-PKCzeta-MEK途径激活血管平滑肌细胞(VSMC)系裂素活化的蛋白激酶或细胞外信号调节激酶(ERK1/2).然而,这不能解释AngⅡ促进VSMC增生的作用可被PI3K的抑制剂Wortmannin所阻断.我们推测PI3K也可能参与了AngⅡ激活的ERK1/2的调节.Western blot和免疫沉淀加Western blot分析显示正常培养的VSMC表达PI3K,AngⅡ和血小板源性生长因子(PDGF)刺激并不影响PI3K的表达,但可提高PI3K对抗其抗体的亲和力.Wortmannin 10 nmol/L可剂量依赖性的抑制AngⅡ和PDGF刺激的ERK1/2激活.有趣的是,我们观察到PI3K和蛋白激酶C(PKC)-zeta受AngⅡ和PDGF刺激后均向Ras转位并与之结合,Ras、 PI3K、PKC-zeta三种蛋白质结合在一起形成一个功能复合体,抗Ras抗体和抗PKC-zeta抗体均可将PI3K沉淀下来,Wortmannin可阻断这个功能复合体的形成,提示PI3K的激活在此功能复合体中起重要作用.此外,MEK抑制剂PD98059(10 μmol/L)作用10 min可剂量依赖性阻断AngⅡ诱导的ERK1/2激活.综合上述结果,说明AngⅡ通过Ras-PI3K/PKCzeta-MEK信号途径刺激ERK1/2活性和VSMC增生.
-
新基因AngRem104与Bardet-Biedl综合征2蛋白的相互作用
目的筛选与新基因AngRem104相互作用的蛋白,并验证AngRem104和Bardet-Biedl综合征2(BBS2)蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用,为进一步研究AngRem104的生理功能奠定基础.方法构建AngRem104的酵母真核表达载体AngRem104-pGBKT7/c-myc,用以转化酵母菌AH109,并与转化了成人肾脏cDNA文库的酵母菌Y187接合,筛选与AngRem104相互作用的蛋白.从中挑选Bardet-Biedl综合征2蛋白进行免疫共沉淀,构建AngRem104-pcDNA3.1/V5-His和BBS2-pCMV/c-myc融合表达载体,共转染HEK293T细胞.分别用小鼠抗人c-myc单克隆抗体和小鼠抗人V5-HRP抗体进行免疫沉淀和免疫印迹,以验证AngRem104和BBS2蛋白间的相互作用.结果以AngRem104为诱饵蛋白在人肾脏cDNA文库中共筛选到包括BBS2在内的7个与之存在相互作用的蛋白.免疫共沉淀结果显示,AngRem104-V5融合蛋白能够在c-myc抗体的免疫沉淀物中检测出来;在V5抗体的免疫沉淀物中也能检测到BBS2-c-myc融合蛋白.结论AngRem104和BBS2蛋白在哺乳动物细胞中存在某种相互作用,为新基因AngRem104功能探讨和Bardet-Biedl综合征发病机制的研究提供了有价值的线索.
-
8-氯腺苷对HL-60细胞中蛋白酶体活性的抑制作用
背景与目的:蛋白酶体是真核细胞中具有多相催化活性的蛋白酶复合体,国外报道,蛋白酶体可作为新靶点来筛选抗肿瘤药物.8-氯腺苷(8-chloroadenosine,8-CA)由本室合成,研究已证实8-CA对肉瘤细胞株S180、肝癌细胞株H22及人胃癌异种移植瘤生长有抑制作用.但8-CA抑制肿瘤生长与蛋白酶体的关系还不清楚.本研究拟探讨8-CA对人早幼粒细胞性白血病细胞HL-60中20S蛋白酶体的三种酶活性(包括糜蛋白酶样活性、胰蛋白酶样活性、多肽-谷氨酰-多肽水解酶活性)的影响.方法:不同浓度的8-CA作用于HL-60细胞24、48、72 h后,提取细胞总蛋白,分别检测总蛋白提取液中20S蛋白酶体的三种酶活性,并采用免疫沉淀法测定纯化蛋白酶体的糜蛋白酶样活性,酶活性均以特异底物被蛋白酶体水解后产生的荧光吸光度表示.结果:0.1 μmol/L 8-CA作用于HL-60细胞48 h,对总蛋白提取液中20S 蛋白酶体的三种酶活性均有显著抑制作用,并且随着8-CA 浓度的增加,其抑制作用逐渐增强.5μmol/L 8-CA作用48 h,对糜蛋白酶样活性、胰蛋白酶样活性、多肽-谷氨酰-多肽水解酶活性抑制率分别为44.96%、54.52%和48.36%;作用72 h,对三种酶活性的抑制率分别为67.53%、70.48%和64.08%.1μmol/L和5μmol/L 8-CA作用48 h,对HL,-60中蛋白酶体的糜蛋白酶样活性抑制率分别为68.14%和92.75%,与对照组相比,差异有显著性(P＜0.01).结论:8-CA对HL-60细胞中20S蛋白酶体的酶活性具有抑制作用,并呈剂量及时间依赖性.
-
应用蛋白印迹-免疫沉淀-质谱法筛选卵巢癌肿瘤抗原
背景与目的:肿瘤抗原的筛选对卵巢癌的早期诊断有重要意义.目前,噬菌体抗体库技术(phage antibody library)、核糖体展示技术(ribosome display)和血清学筛选重组cDNA表达文库(serological analysis of recombinant cDNA expression libraries,SEREX)技术等作为常用的肿瘤抗原筛选方法已得到广泛应用.本研究采用蛋白印迹-免疫沉淀-质谱方法筛选和鉴定卵巢癌肿瘤抗原,以期建立一种新的筛选肿瘤抗原的方法及技术路线.方法:应用蛋白印迹(Western blot)法筛选出差异明显的卵巢癌患者血清,用该血清与SKOV3细胞裂解物反应,免疫沉淀富集抗原,与正常血清的免疫沉淀样品比较,获得差异蛋白条带,然后进行质谱鉴定、生物信息学分析.结果:采用蛋白印迹筛选到标记为7号的卵巢癌患者血清,与其他血清比较有明显的差异,经免疫沉淀、聚丙烯酰胺凝胶电泳与正常血清免疫沉淀样品比较,发现在接近66.2 ku的位置处有一差异蛋白条带,经质谱鉴定、生物信息学分析为热休克蛋白(heat shock protein,HSP)70及细胞角蛋白(cytokeratin)9.结论:采用蛋白印迹-免疫沉淀-质谱法进行卵巢癌肿瘤抗原的筛选和鉴定是一种行之有效的方法.
关键词： 卵巢肿瘤 肿瘤抗原/分离和提纯 免疫沉淀 质谱 -
抗人半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2单克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(Cysteine and glycine-rich protein 2,CRP2)的单克隆抗体,探讨CRP2蛋白的生物学功能.方法 利用重组CBP2蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行常规融合,通过间接ELISA筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗CRP2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过ELISA,Western-blot和免疫共沉淀实验等方法对其特性进行鉴定.结果 成功地建立了2株稳定分泌抗CRF2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为F001和F002.两株单克隆抗体与重组抗原有较强的特异性反应.同时,两株单克隆抗体通过Western-Blot实验都能特异性地结合真核细胞内源性的CRP2蛋白,并且,两株抗体都可以应用于免疫共沉淀实验.结论 获得了效价高、特异性好的CRP2蛋白的单克隆抗体,为CRP2的生物学功能研究奠定了基础.
-
三种小干扰RNA干扰VP16 mRNA对单纯疱疹病毒-1复制的影响研究
目的 探讨体外合成小干扰RNA(siRNA),在RNA干扰(RNAi)技术条件下,单纯疱疹病毒-1(HSV-1)感染Vero细胞过程中,病毒间层蛋白VP16的生物学功能.方法 用T7 RNA聚合酶体外合成针对VP16 mRNA的三种siRNA.用脂质体2000转染Vero细胞后接种HSV-1,感染后不同时相点(12,24,36,48,60,72h pi)分别采取实验组(R)和对照组(C)标本,检测病毒滴度值,绘制子代病毒一步生长曲线.用同位素标记新合成的VP16进行免疫沉淀法检测病毒蛋白表达的变化.结果 病毒子代一步生长曲线显示,转染siRNA的实验组Vero细胞接种HSV-1后24h(24hpi),病毒滴度明显低于对照组;12h pi也观察到病毒滴度低于对照组的现象;多位点的siRNA具有协同作用;实验组病毒滴度高峰出现时间后移大约12h.siRNA影响了病毒的蛋白表达.结论 T7RNA聚合酶体外合成的siRNA可以用于RNAi技术研究;HSV-1间层蛋白VP16对病毒复制和组装、成熟起重要的生物学作用.
-
结肠癌相关抗原的纯化与分析
目的 从培养的人结肠腺癌细胞系LS-180细胞中纯化结肠癌相关抗原,并对其基本特性进行分析,探讨其在结肠癌组织中的表达.方法 以人结肠腺癌细胞LS-180免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,通过有限稀释法得到能稳定分泌抗LS-180细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株.再以5×106/mL腹腔注射BALB/c小鼠,收集腹水.裂解LS-180细胞,通过抗结肠癌相关抗原mAb SCAb8与免疫沉淀柱偶联进行免疫沉淀纯化结肠癌相关抗原SC8.浓缩后经SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对纯化抗原进行鉴定.并用免疫组化的方法检测该抗原在结肠癌组织及正常组织和其他癌组织中的表达.结果 纯化所获结肠癌相关抗原SC8,其相对分子质量(Mr)约为61 000,由30 000和31 000两种亚基组成,免疫组化实验表明,SC8在结肠癌组织中有较高的表达,与癌旁正常组织及其他癌组织相比存在显著的统计学差异(P＜0.05).结论 利用单克隆抗体SCAb8进行免疫沉淀,从人结肠腺癌细胞LS-180中获得纯化的肿瘤相关抗原SC8,该抗原有可能在临床上为结肠癌的诊断和治疗提供一定的参考价值.
-
系统性红斑狼疮中内皮细胞相关自身抗原的鉴定
目的 在内皮细胞中筛选与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)疾病相关的自身抗原.方法 用免疫沉淀法以SLE病人血清中自身抗体捕获人脐带内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)相关抗原,并用双向电泳法分离免疫沉淀产物,然后用LC-MS-MS串联质谱鉴定与SLE病人血清反应的蛋白点.后用Western blot法验证部分鉴定蛋白.结果 相对于正常人血清对照,SLE病人血清捕获了多个内皮细胞相关蛋白,质谱鉴定结果 显示:通过免疫沉淀与双向电泳结合的方法 成功鉴定了包括GAPDH等已知SLE自身抗原在内的一系列蛋白,其中钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK)为新发现SLE候选自身抗原.并以重组人CASK蛋白证实SLE病人血清中CASK抗体水平显著高于正常人对照.结论 内皮细胞蛋白CASK可能作为一个新的SLE相关自身抗原.
