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人P21活化激酶4文献资料
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3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位
目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白.方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag 标签的真核表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位.使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白.结果:hPAK4 全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp.Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白.结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白.3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中.
