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应用免疫蛋白质组学方法鉴定弓形虫病诊断抗原分子的研究
目的 鉴定对弓形虫感染具有潜在诊断价值的弓形虫抗原分子.方法 制备刚地弓形虫RH株速殖子全虫可溶性蛋白及弓形虫感染小鼠腹腔蛋白,经SDS-PAGE分离后采用半干电转移方法将其转移到硝酸纤维素膜上,再分别与22份弓形虫感染者血清进行Western blot,以22份健康人血清和其他寄生虫病患者血清作为对照,筛选能被弓形虫感染者血清特异性识别的蛋白组分;两种蛋白样本经二维电泳分离后采用Western blot筛选能被弓形虫感染者混合血清识别,但不能被健康人血清及其他寄生虫病患者血清识别的特异性斑点.切取SDS-PAGE胶上相应的特异性蛋白质斑点进行MALDI-TOF分析,鉴定蛋白斑点的基因.结果 一维电泳及Western blot结果显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的90、37、30、28和18 ku组分分别可被部分弓形虫感染者血清识别,其中为28 ku蛋白能被22份弓形虫感染病人血清中的15份所识别;速殖子全虫可溶性虫体蛋白中的90、70、67、56、48、39、37、30、28和18 ku组分可被部分弓形虫感染者血清识别,其中28 ku蛋白可被22份弓形虫感染者血清中的21份识别,22份健康人血清中有2份与28 ku蛋白呈弱阳性反应,与其他寄生虫病患者血清无交叉反应.二维电泳Western blot阳性斑点的飞行质谱分析显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的28 ku组分为磷酸丙糖异构酶,弓形虫速殖子全虫可溶性蛋白中的28 ku组分为GRA2和GRA7.结论 弓形虫抗原与宿主抗体反应具有高度异质性,GRA2、GRA7及磷酸丙糖异构酶等分子的弓形虫感染者血清识别率高,此三种蛋白可作为建立具有高敏感性的弓形虫病特异性免疫诊断方法的抗原分子.
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抗弓形虫单克隆抗体的制备鉴定及应用
目的 制备抗弓形虫全抗原、天然P30、重组P30的单克隆抗体(McAb),为抗原提纯、弓形虫病诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础.方法 用弓形虫全抗原、天然P30、重组P30分别免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选稳定分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株.用ELISA法测定McAb亚类和效价;通过SDS-PAGE和Western blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目;利用电镜及IFAT观察McAb对弓形虫的杀伤作用及其作用位点.结果 筛选出3株(4B10、2B3、1H6)特异性较好的杂交瘤细胞株.Western blot结果显示,2B3、1H6产生的McAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30 kDa处,4B10反应带主要在22 kDa处;2B3,1H6,4B10 McAb的效价(ELISA)分别为:1:102 400、1:51 200、1:12 800;2B3、1H6为IgM,4B10为IgG2b;3株细胞的染色体数均在100条以上.电镜观察到McAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀,表面出现缺口和空洞,虫体变形破碎、膜变厚.抗弓形虫全抗原及天然P30的McAb能准确识别重组体pET-30a-ROP2、pET-30a-P30的表达蛋白.结论 抗弓形虫全抗原、P30抗原的McAb均对弓形虫具有明显的杀伤作用,能准确识别P30抗原,可应用于弓形虫病诊断、抗原鉴定及亚单位疫苗的研制.
