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抗赭曲霉素A单克隆杂交瘤细胞系的建立及特性
为快速检测食物中的赭曲霉素A,建立了抗Ochratoxin A的单克隆杂交瘤细胞株.用OA-匙孔嘁血蓝素(OA-KLH)偶联物免疫8～10周龄雌性Balb/c小鼠后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立了3个稳定分泌抗赭曲霉素A抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10G7、10G10和5G11.将上述3株杂交瘤细胞分别注入Balb/c小鼠腹腔,获得含抗赭曲霉素A单克隆抗体的腹水.将腹水用饱和硫酸铵法纯化,得到10G7、10G10和5G11单克隆抗体.其中10G10、5G11单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,10G7单克隆抗体的Ig亚类为IgG2a.抗体腹水的稀释度为1:6.4×106～1:1.3×108,参考工作浓度为1:1.0×106～1:3.2×107.纯化后10G7抗体的IgG含量为16.4 g/L,亲和常数为9×10-8 mol/L.10G7抗体与其它结构类似物无交叉反应,具有较高的特异性.
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抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的制备及特性
目的 研制能够与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2有较好交叉反应的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体.方法 利用B细胞杂交瘤技术,建立分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体杂交瘤细胞株.结果 建立了1株稳定分泌抗总黄曲霉毒素抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G2.该细胞株所分泌的单克隆抗体Ig亚类为IgG1,参考工作浓度为1:1.6×106,亲和力常数为8×10-8 mol/L.该抗体与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应分别为100.0%、57.5%、104.0%和19.0%,与其他真菌毒素无交叉反应.结论 制备出能分泌具有高特异性和亲和力的抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株.
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小分子单克隆抗体的制备与敲除技术研究进展
随着单克隆抗体技术应用的愈加广泛,其生产技术也日臻完善.小分子单克隆抗体技术也日益成为人们研究的热点课题.中药小分子单克隆抗体技术的应用也日益广泛,这门技术给中药有效成分的敲除提供有力的技术支持.该文就小分子单克隆抗体制备与敲除技术进行了综述.就其制备过程中的几个步骤,如:半抗原的制备,半抗原与载体偶联,人工抗原的鉴定及偶联比率的测定,动物免疫与单克隆杂交瘤细胞株的建立,单克隆抗体的大规模制备;小分子单克隆抗体的敲除技术的免疫亲和色谱柱的方法进行了详尽的阐述.笔者相信这门技术会使得中药的研究上更高一个层次,并且提高中药研究的国际化水平.
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中华蜜蜂囊状幼虫病病毒单克隆抗体的制备与鉴定
为了制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)单克隆抗体,本实验利用纯化的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)免疫Balb/c小鼠,经过3次免疫后,小鼠断尾采血测其血清效价,选择效价高于l∶80 000的小鼠,在细胞融合前3～4d再加强免疫一次.取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后注射入Balb/c小鼠(Mus musculus)腹腔制备单抗腹水.共获得9株稳定分泌抗CSBV的单克隆抗体,命名为10A1、5B10、5A5、5H2、11D7、9A5、1D3、3C10、10C4,效价都在1∶16 000以上,经间接ELISA实验检测表明,具有较好的特异性.在此基础上,将9株腹水单抗分别与CSBV互作后,接种于2～3日龄中华蜜蜂幼虫,观察幼虫死亡率,研究单克隆抗体中和CSBV病毒能力,结果表明筛选到三株单克隆抗体(l0A1、5A5、9A5)对CSBV有中和作用,为CSBV的防治研究奠定了基础.
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抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体的研究
埃博拉病毒感染致死率高可达90％,属烈性传染病,检测诊断对于疫情控制就显得异常重要.目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊,但耗时相对较长,对检测的人员和仪器要求较高.ELISA法检测血清是病原学诊断的主要指标,该种检测方法简单易操作,能够有效判断患者是否感染埃博拉以及感染程度,可用于流行病学调查,血清学指标的检测可以作为核酸检测的有力补充.由于埃博拉出血热在我国境内尚无病例出现,尤其需要储备血清学检测阳性质控物.通过基因工程抗体技术构建并表达抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体,为埃博拉出血热血清学检测做人源阳性对照储备.采用RT-PCR技术,从分泌抗埃博拉核蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株中分离克隆抗体轻重链可变区基因,对其进行序列分析.根据序列分析的结果,设计特异性引物将鼠源抗体可变区基因VH、VL分别克隆至携带有人抗体轻重链恒定区基因的真核表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞,表达并纯化获得人鼠嵌合IgG抗体,随后对其进行了免疫学检测和功能鉴定.结果表明正确构建抗埃博拉病毒核蛋白人鼠嵌合抗体真核表达载体,成功表达并纯化获得两株人鼠嵌合单抗.
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抗人BPI23单克隆抗体的制备和鉴定
目的 采用杂交瘤技术制备抗人BPI23单克隆抗体,并对其应用进行初步分析.方法 免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按常规方法融合;用问接ELISA法和Western-blot筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法亚克隆3次获得稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单抗并对抗体类型进行鉴定;用Western-blot分析抗体的特异性;用间接ELISA法测抗体效价;将分离纯化的正常人外周血中性粒细胞和单个核细胞制成涂片,用抗人BPI23单克隆抗体进行免疫染色.结果 获得3个(1B4、9C12:和2H11)稳定分泌抗人BPI23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型分别为κ型IgM、κ型IgG1和κ型IgG1;抗体效价分别为1.28×105、1.28×105和4.1×106,纯化后抗体含量分别为0.208 g/L、2.03 g/L和3.88 g/L;3种纯化抗体均能与本实验制备的人BPI23和市售人BPI55标准品特异性结合,而不能与小鼠BPI25和人LBP结合;在免疫组化实验中,1B4、9C12:和2H11单抗均能与人中性粒细胞中的BPI特异性结合.结论 成功制备了人BPI23特异性单克隆抗体,为BPI检测试剂盒的研制奠定了基础.
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抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定
目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定. 方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化.ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应.电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性. 结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株.电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM).B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1 280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高.2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应. 结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础.
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抗旋毛虫副肌球蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
目的 利用杂交瘤技术制备分泌抗重组旋毛虫副肌球蛋白N端抗原(rTsP3)的单克隆抗体(McAb)并进行鉴定. 方法 以rTsP3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,筛选分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,制备腹水并进行纯化,采用间接ELISA法测定培养细胞上清液及腹水中的McAb滴度、相对亲和力及抗体亚类,Western blot法鉴定抗体对抗原识别的特异性. 结果 获得了2株稳定分泌抗旋毛虫rTsP3的McAb杂交瘤细胞株,分泌的McAb分别为IgG2b亚类κ型和IgG1亚类κ型,亲和力常数分别为8.98×108 mol/L和9.7×108 mol/L,Western blot显示2株单抗均能识别旋毛虫成虫匀浆蛋白、rTsP3及重组副肌球蛋白(rTsPmy). 结论 成功制备了抗旋毛虫rTsP3 单克隆抗体,该单抗能识别旋毛虫副肌球蛋白抗原.
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培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用
在生物制剂的生产和研发领域,细胞培养扮演着极其重要的角色;用原代细胞或传代细胞制造疫苗;杂交瘤细胞制造单克隆抗体;基因工程或细胞生物学的研究等[1].然而支原体污染常常成为细胞培养的不速之客,严重影响着细胞及生物制剂的质量.污染细胞常见的支原体包括:发醉支原体（M.fementans）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginina）、梨支原体（M.pirum）、唾液支原体（M.salivarium）和人型支原体(M.hominis)[2-3].被这些支原体污染的细胞常常不引起明显的细胞病变,也不导致培养液浑浊,难以凭肉眼发现,因此,建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要.
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单克隆抗体及基因工程抗体在医学诊断上的应用
一、传统的单克隆抗体及其应用1975年德国学者Kohler和美国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合,形成的部分杂交瘤细胞(hybridoma),既具有大量无限生长的特性,又具有合成和分泌抗体的能力.它们是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体,称为单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAb),从而开创了抗体技术的新纪元,被称为第二代抗体.它的特点是特异性针对单一抗原决定簇,理化性状高度均一、生物活性单一,与抗原结合的特异性强,便于人为处理和质量控制,并且来源容易.这些优点使它一问世便受到高度重视,并广泛应用于生物学和医学研究领域.
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白内障术后后囊浑浊的防治和抗人晶状体上皮细胞单克隆抗体的制备
目的 制备可特异性识别人晶状体上皮细胞的单克隆抗体,筛选特异性强亲和力高的克隆.方法 以原代培养人晶状体上皮细胞作为免疫原,使用杂交瘤技术制备抗人晶状体上皮细胞单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb).小鼠腹腔接种杂交瘤细胞制备腹水,用免疫荧光、免疫组化法对其特性进行鉴定.结果 获得了1株稳定分泌抗人晶状体上皮细胞McAb的杂交瘤细胞系,其亚类为IgM.免疫荧光和免疫组化检测结果显示,此McAb与人晶状体上皮细胞膜上的抗原反应,与人眼其他组织呈阴性反应.结论 所获抗体可特异性识别人晶状体上皮细胞,可进一步制备免疫导向药物,用于白内障术后后囊浑浊的治疗.
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海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠微囊包裹杂交瘤细胞的研究
目的对海藻酸钠-聚左赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊包裹杂交瘤细胞进行初步研究.方法用人IgG1免疫小鼠,取免疫后脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞融合,获得分泌抗人IgGк链单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,命名为JY-A1;通过优化制备条件,制备包裹杂交瘤细胞的APA微囊,并考察形态学;比较不同微囊膜的机械强度和化学强度;用ELISA法测定mAb的释放.小鼠腹腔注射微囊,不同时间回收观察.结果相同条件下制得的微囊粒径均匀、表面光滑.体外培养条件下mAb能持续透过微囊膜.小鼠腹腔注射微囊后无异常,回收的微囊大部分形态完整.结论采用高压静电成囊技术制备的APA微囊具有较高的膜强度,对细胞分泌产物mAb能持续稳定释放,在小鼠体内有较好的生物相容性.
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乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体的制备及初步应用
目的 制备乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体,应用于猪源性生物制品中JEV的检测.方法 提纯病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得4株杂交瘤细胞,并应用琼脂扩散、酶联免疫吸附试验和免疫荧光方法进行抗体鉴定和样品检测.结果 获得4株稳定分泌JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株G10、F4、C10、A5,免疫荧光抗体实验证实是特异的抗JEV抗体,其免疫球蛋白亚类G10和F4为IgG1,A5为IgM,C10未鉴定出其亚类.G10和F4腹水效价为105以上,C10和A5腹水效价为102以上.结论 成功制备了抗JEV单克隆抗体,建立了以单抗介导的间接ELISA和间接IFA检测方法,并应用于猪源性生物制品中JEV的检测.
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细胞支原体污染清除方法比较及清除后的应用
目的：探讨使用几种支原体清除方法后，细胞支原体清除效果及所制备抗体应用于相应平台的对比。方法选用4种方法进行清除支原体。结果通过PCR法鉴定，只有清除剂法及实体瘤法可清除支原体感染。结论杂交瘤细胞清除支原体感染后，制备所得抗体应用于相应平台可见，清除剂法对细胞损伤较大，抗体相应功能下降；而实体瘤法教温和，抗体相应功能保持较完好。
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肿瘤分子靶向治疗进展(二)临床常用分子靶向药物
单克隆抗体1975年Koehler等采用细胞融合技术,使小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞,后者产生的抗体,称为单克隆抗体(monoclonal antibody,MoAb),简称单抗,由于单抗具有性质纯、效价高、特异性强,少或无血清交叉反应等特点,已被广泛应用于肿瘤的治疗.
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达克宁在细胞克隆技术中的应用
能否有效地控制分泌特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞的污染,是该项研究中常遇到的问题,由于细菌耐药性的产生,传统应用双抗处理的方法多难于奏效.在杂交瘤细胞融合培养过程中,有时会发生真菌污染的现象.为防止和清除真菌污染,除了严格控制操作,还可采用小鼠腹腔和使用抗真菌药物的方法.目前,国内抗真菌药物如制霉菌素对杂交瘤细胞的毒性较大,抑制真菌效果不理想.我们在实验研究过程中使用达克宁注射液(有效成份为咪康唑)挽救意外污染了真菌的杂交瘤细胞,取得了良好的效果.
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流感病毒A单抗杂交瘤细胞cDNA文库的构建
目的 应用SuperSciptTMⅡ RnaseH- Reverse Transcriptase 建库试剂盒建立了流感病毒A单抗杂交瘤细胞cDNA文库.方法 取流感病毒A单抗杂交瘤细胞,进行体外培养,提取mRNA,并将其反转录成cDNA,与EcoRI接头连接后插入pBluescriptⅡ SK(+)XR载体,体外包装后转染到DH10B宿主菌中,进行滴度测试及文库扩增.结果 构建的流感病毒A单抗杂交瘤细胞cDNA 文库含1.07×106重组子,重组率87.5%,插入片段长度约为500～2000 bp.扩增后的文库浓度为3.2×107重组子/μl,将文库稀释到10-6时所产生的噬菌斑密度为适宜.结论 试验结果表明,该库符合标准,所构建的流感病毒A单抗杂交瘤细胞cDNA 文库为进一步筛选目的 基因、制作基因芯片等提供了有效的工具.
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杂交瘤细胞染色体制备及生物学意义初探
目的:改进杂交瘤细胞培养及染色体制备方法.方法:取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0常规融合,用不同的培养基制备杂交瘤细胞,并在制备杂交瘤染色体时改变秋水仙素作用的时间.结果:12孔板中加入DMEM培养液的杂交瘤细胞株生长良好,其中6孔板加秋水仙素培养1h,染色体形态佳,数目稳定.结论:DMEM培养液更适合此种杂交瘤细胞的培养.制作染色体时缩短秋水仙素培养时间,使得杂交瘤细胞染色体形态更接近于两种亲本细胞.
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应用Protein A亲和层析法制备及纯化R1JHL单克隆抗体
[目的]制备、纯化N-甲基D-门冬氨酸受体(NMDAR,NR)主亚基RIJHL单克隆抗体.[方法]NR1杂交瘤细胞腹腔注射BalB/C小鼠制备抗体,Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析纯化单抗,Western-blot鉴定该单抗特异性.[结果]纯化后单抗识别大鼠脑组织膜蛋白中约115 kD大小的单一条带.[结论]制备、纯化了具有高度特异性的抗NR1单克隆抗体,为进一步研究NMDA受体提供了工具.
关键词： NMDA受体 杂交瘤细胞 单克隆抗体制备纯化 Western-Blot -
应用抗真菌药物处理染菌杂交瘤细胞对抗体产生的影响
应用淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术几乎可以获得任何针对某个抗原决定簇的高纯度抗体.杂交瘤细胞的获得和培养是一项长期进行的频繁操作过程,所用培养液和条件也非常适合细菌、真菌等微生物生长,所以,防治培养细胞受到污染是纯化单克隆抗体成功关键.在进行细胞培养的各个环节虽然十分重视灭菌与无菌操作,但细菌、真菌污染仍时有发生.一旦发生染菌,抢救工作不但麻烦,而且还不一定成功[1],特别是发生真菌污染时,往往会导致本次培养工作失败.我们应用抗真菌药物处理染菌的杂交瘤细胞,并观察其对小鼠产生腹水和抗体量的影响,现将实验结果报道如下.
