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原代细胞永生化的研究进展
现代生物技术一般包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术,而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系,细胞培养更具有特殊的作用和价值.有学者研究发现,由于永生化细胞在体内可多次传代,具有相对稳定的增殖特性和功能状态,将其作为细胞工程和组织工程等研究领域的标准细胞,促进了体外实验的标准化和科学化[1].费氏病毒学[2]指出,原代细胞的培养是直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养,此时的细胞保持原有细胞的基本性质,更有利于进行病原体感染的体内微环境、抗病毒药物筛选等研究,但是原代细胞只具有2~3次的复制繁殖传代周期,对开展细胞研究具有一定的局限.原代细胞永生化技术在未来的成功应用,不仅为生物制品的研究与开发提供了有力工具,而且也为难培养病毒的体外培养、疾病的诊断与治疗提出了新的思路[3].
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2-甲氧基雌二醇对原代骨髓瘤细胞分化的作用
本研究观察2-甲氧基雌二醇对多发性骨髓瘤患者原代细胞诱导的分化作用.采用CD138+磁珠分离纯化7例骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞,通过形态观察、细胞表面标志分析和细胞分泌轻链蛋白的情况,观察2-甲氧基雌二醇对多发性骨髓瘤原代骨髓瘤细胞分化的影响.结果表明:患者原代骨髓瘤细胞经0.5 μmol/L2-甲氧基雌二醇分别作用36及72小时后,细胞形态向成熟阶段发展,表现为细胞胞核缩小,胞浆丰富,核浆比例下降,核仁减少或消失,核染色质变粗、变密.CD49e阳性细胞率由(11.02±1.75)%(DMSO对照组)增加到(23.80±1.62)%(36小时组)及(35.68±1.85)%(72小时组),差异具有统计学意义(P<0.05);细胞分泌轻链蛋白由(225.7±30.4)ng/ml(DMSO对照组)升高到(296.7±18.8)ng/ml(36小时组)及(378.9±15.8)ng/ml(72小时组),差异具有统计学意义(P<0.05).结论:较低浓度2-甲氧基雌二醇可诱导骨髓瘤患者原代骨髓瘤细胞向成熟阶段分化.
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培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用
在生物制剂的生产和研发领域,细胞培养扮演着极其重要的角色;用原代细胞或传代细胞制造疫苗;杂交瘤细胞制造单克隆抗体;基因工程或细胞生物学的研究等[1].然而支原体污染常常成为细胞培养的不速之客,严重影响着细胞及生物制剂的质量.污染细胞常见的支原体包括:发醉支原体(M.fementans)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginina)、梨支原体(M.pirum)、唾液支原体(M.salivarium)和人型支原体(M.hominis)[2-3].被这些支原体污染的细胞常常不引起明显的细胞病变,也不导致培养液浑浊,难以凭肉眼发现,因此,建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要.
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生物技术药物中宿主DNA残留Q-PCR检测法的方法验证
自20世纪50年代,用于生产生物技术药物的细胞基质一直因其安全性而备受关注,生产用基质细胞经历了从原代细胞,二倍体细胞到传代细胞的发展历程,人们对其潜在风险的认识也在不断变化。虽然,至今没有因为生物制品中 DNA残留量而引发不良反应或安全事故,但其用量随着临床治疗的需求越来越大,需要长期反复用药的生物制品也越来越多,同时,疫苗的使用者为健康人群,这些都使得药品监管部门更加重视生物技术产品的安全性,其中 DNA残留量的质量控制一直是人们关注的热点。几十年来对于残余 DNA问题的争论一直在继续,有的观点认为应将残余 DNA作为一种重要危险因素[1],也有人倾向于将残余 DNA作为一般杂质控制。各国研究机构围绕着残余 DNA问题都做了大量的工作,国内外也有很多有关细胞基质及残余 DNA的文献和技术指南发表[2-4]。但根据现有研究结果,现在认为应将其视为一般杂质,并控制其在生物制品中的含量达到纯化工艺可控制的低量。
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柯萨奇B组3型、5型病毒在人脐静脉血管内皮细胞中持续感染模型的建立
柯萨奇B组病毒(group B coxsackieviruses, CVB)可引起人类多种疾病.如病毒性心肌炎,有的患者可转为慢性,晚期形成扩张型心肌病,导致心衰,预后不良.目前认为扩张型心肌病的病因与病毒在心肌组织中的持续存在有关[1].CVB可形成病毒血症,侵入血管内皮细胞或经血管内皮细胞穿越内皮屏障,感染相应靶组织.ECV304为一株自发突变为可传代的人脐静脉内皮细胞,其主要生物学特性与原代细胞相似.本研究在ECV304细胞中建立CVB3、CVB5持续感染的细胞模型,通过对病毒、细胞各种指标的检测,印证病毒长期存在于感染细胞中.为病毒性心肌炎及扩张型心肌病发病机制的深入研究及治疗药物的筛选提供参考依据.
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大肠癌细胞可产生趋化因子IP-10
目的:通过大肠癌细胞的原代培养和大肠癌细胞株的培养,探讨大肠癌细胞能否产生趋化因子,产生趋化因子的条件及其产生的动力学情况.方法:分别用α-TNF,γ-IFN及IL-1刺激培养原代细胞及细胞株.采用RT-PCR方法检测培养细胞趋化因子IP-10mRNA的表达.结果:大肠癌细胞在原代培养下经α-TNF、γ-IFN、IL-1的刺激可表达IP-10 mRNA.大肠癌细胞株Colo320经α-TNF,γ-IFN或IL-1的刺激可表达IP-10 mRNA.Colo320的IP-10 mRNA表达依刺激因子浓度和时间的改变而改变.结论:大肠癌细胞在一定的条件下能够表达趋化因子如IP-10mRNA等.
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小鼠原代胰腺腺泡细胞分离提纯的简化方法
目的 探索一种简单、经济的小鼠胰腺腺泡细胞分离提纯的新方法.方法 采用胶原酶、胰蛋白酶抑制剂溶于DMEM细胞培养液消化小鼠胰腺,DMEM联合4% BSA溶液提纯胰腺腺泡细胞.采用CCK-8法检测胰腺腺泡细胞分泌淀粉酶的能力.结果 经过消化、水浴、重悬、过滤、沉淀,在2h内即可快速分离出小鼠原代胰腺腺泡细胞.状态较好的腺泡细胞多呈团状,其基底外侧区域表面呈光滑圆形且没有泡状物,胞质清晰,顶端区域被数百个酶原颗粒包围,颜色较暗,细胞核位于囊泡状区域的基底部.未加CCK-8刺激组腺泡细胞的淀粉酶基础分泌水平约占总淀粉酶分泌水平的2.5%,CCK-8刺激后腺泡细胞分泌的淀粉酶水平升高,在CCK-8浓度为50 pmol/L时达到峰值[(12.83±1.04)%],之后随着CCK-8浓度增加细胞分泌的淀粉酶水平/总淀粉酶水平百分比下降.结论 本研究改进的方法具有快速、简便、技术难度小、重复性好的特点,是一种简化而又经济的小鼠胰腺腺泡细胞分离纯化新方法.
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青蒿素对人白血病细胞株和原代细胞的影响
青蒿素是一种低毒、有效的抗疟药,近发现其有抑制实体瘤细胞增殖的作用[1,2].我们研究了青蒿素对人白血病细胞株和原代细胞的影响及可能机制,以期为其抗白血病新用途提供实验证据.
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成骨细胞体外培养模型的研究进展
多种细胞参与骨的形成、重建和修复过程,其中成骨细胞的作用尤为重要,它不仅调节骨的矿化,还间接调节骨吸收功能,它的数量和功能变化直接影响多种骨骼疾病的发生、发展和预后。作为骨组织中重要的力学感受细胞和成骨效应细胞,它的功能及调节机制已成为骨生物学研究的重中之重。目前用于研究成骨细胞生物学特性的细胞模型种类繁多,而每种模型都有其自身特点,在选择实验对象时需要对其生物学特性进行综合评估。本文将针对成骨细胞不同种属来源的原代细胞和细胞系作一简要概述。
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乳腺癌干细胞的端粒酶活性测定及其意义
我们检测了人乳腺癌原代细胞以及MCF-7中的CD44和CD24表达情况,并检测了其中不同细胞亚群的端粒酶的表达活性,现报告如下.
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乳腺癌细胞的原代分离培养及药物敏感性试验研究
化疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分,在化疗前预测化疗药物是否敏感,实现化疗的个体化,则既能提高化疗效果,又能减少不必要的化疗药物给病人带来的不良反应.但目前用于筛选的药物浓度标准并不一致,我们采用乳腺癌手种术标本进行分离,取得原代细胞,再进行药物敏感性试验,结合临床,探索出用于临床筛选的佳药物浓度.
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人阴道上皮鳞状细胞的体外培养及其生物学特性
近年来,女性生殖道局部免疫防御机制的研究受到重视,初步研究显示,外界微生物入侵时,生殖道上皮细胞可分泌具有杀伤作用的细胞因子,如人类防御素、白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等,同时促进阴道局部特异性细胞免疫的建立[1-2].20世纪90年代末,美国学者Fichorova等[3]已经建立了人阴道上皮细胞模型,并将阴道上皮的原代细胞进行传代,Steele和Fidel[4]借用此细胞系进行了衣原体感染的初步研究.
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一种合成的纳米粒高分子材料的细胞毒性研究
目的 检测本实验室新合成的准备应用于静脉注射的系列高分子材料poly(ethylene glycol)-D,L-lactic and glycolic acid-poly(ethylene glycol)(mPEG-PLGA-mPEG,PELGE)以及由其制成的纳米粒对多种细胞的细胞毒性.方法 利用快速评定细胞增殖率和细胞毒性的噻唑蓝比色法(MTT),不仅参照美国药典用小鼠成纤维细胞L929细胞株进行评价,还根据该材料将来可能的应用领域,用Chang氏正常肝细胞株,原代人肾血管内皮细胞,原代人胚成骨细胞,原代人胚成肌细胞评价其细胞毒性.结果 结果表明该系列聚合物对L929细胞株24 h内和内皮细胞48 h内的毒性为0或I级,即无细胞毒性,而对其它不同种细胞具有不同程度的细胞毒性.结论 该材料具有应用于静脉注射的可能性.该实验为进一步的动物试验提供依据,同时为该新型材料应用于实际提供了前提检测方法.
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人脐静脉内皮细胞的研究和应用
血管内皮细胞在人体多种生理和病理过程中发挥重要作用,一直以来都是研究的热点.其中使用广泛的当属人脐静脉内皮细胞,然而就其各种亚系细胞有何特点和优劣,国内尚未见报道.现通过总结原代人脐静脉内皮细胞、延长寿命的脐静脉内皮细胞系、永生化的脐静脉内皮细胞系等在医学研究领域的应用和进展,对不同种类之间优势和局限性进行比较,从而更好地指导实际运用.
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非小细胞肺癌吉西他滨化疗敏感性预测
目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)吉西他滨(GEM)化疗敏感性预测靶标。方法30例NSCLC组织,体外药敏试验明确GEM IC50值;Realtime-PCR检测GEM代谢酶hENT1、dCK、RRM1和RRM2 mRNA表达水平。结果 hENT1、dCK、RRM1和RRM2单个基因表达量与GEM IC50值无关(P>0.05);(hENT1×dCK)/(RRM1×RRM2)值与GEM IC50值呈负相关(P<0.001)。结论(hENT1×dCK)/(RRM1×RRM2)值可作为GEM化疗敏感性预测的潜在标志物。
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软骨细胞特殊染色技术的比较与应用
目的:探讨多种特殊染色技术在软骨细胞中的染色规律及其应用价值。方法选取出生7d内的C57BL/6J小鼠12只,处死后取双侧膝关节软骨行软骨细胞原代培养,并行II型胶原免疫荧光鉴定,取5代以内的原代细胞制作细胞爬片,细胞爬片制备完成后行HE染色、番红O-固绿双染色、SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色及II型胶原免疫组化染色,观察软骨细胞组织形态变化,并对几种染色方式进行比较。结果 HE染色中细胞核呈紫蓝色,细胞质呈粉红色,细胞形态结构清楚;番红O-固绿双染色中细胞核呈粉红色,细胞质呈蓝绿色,细胞形态结果较清晰;SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色时,衰老软骨细胞呈绿色,未衰老细胞无着色;II型胶原免疫组化染色时,II型胶原呈棕黄色,细胞核呈紫蓝色。结论 HE染色和番红O-固绿双染色可以清晰分辨细胞核和细胞质等细胞结构,对单个细胞形态的显示比较清楚;SA-β半染糖苷酶半乳糖苷酶衰老染色可以显示出衰老细胞的数量及衰老的程度;II型胶原免疫组化染色可以对II型胶原进行定位与定量。
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川芎嗪及大蒜素对剪应力诱导的内皮细胞分泌血管性血友病因子与血小板聚集的影响
模拟体内血管壁-血液-血流相互作用,观察川芎嗪和大蒜素对剪应力诱导的血管内皮细胞(EC)分泌血管性血友病因子(von Willibrand factor,vWF)以及血小板聚集的影响,为川芎嗪和大蒜素的临床应用提供实验依据.一、材料与方法1.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)培养:采用胶原酶消化法分离细胞,并将其接种在特制的直径为45mm的光学玻璃片上(预先用0.5%的明胶包被),细胞种植密度(4~9)×105个/玻片.以原代细胞进行剪切实验.
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多发性骨髓瘤原代细胞异种移植小鼠模型的建立
目的 利用人多发性骨髓瘤(MM)原代细胞在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中建立人MM异种移植模型.方法 将2例MM终末期患者骨髓或外周血单个核细胞(MNC)悬液通过尾静脉分别输注给3只NOD/SCID小鼠.每周称量体重,移植2周后以流式细胞术(FCM)检测小鼠外周血中CD45+细胞百分比.当小鼠出现苍白、竖毛、精神萎靡或体重下降20%时,取小鼠脾脏及肝脏行组织病理学检查,FCM检测外周血、骨髓、脾脏和淋巴结细胞悬液中CD45+ CD38+细胞的百分比.结果 来源于病例1和病例2的MNC移植小鼠的平均体重分别自输注MM原代细胞第7周和第5周后开始下降;以对照组小鼠的单个核细胞做阴性设门,分别于移植(26±4)d和(16±4)d后,在病例1细胞来源组和病例2细胞来源组的小鼠外周血中检测到人CD45+ CD38+细胞,且其比例随时间延长而逐渐增高,实验终点时分别达(16.2±3.0)%和(31.3±3.5)%;组织病理大体形态观察发现小鼠脾脏、肝脏及淋巴结均不同程度增大,镜下可见典型的恶性浆细胞浸润;FCM检查骨髓、淋巴结和脾脏细胞表面标志,均发现一群人源CD45+ CD38+细胞.结论 成功建立了人MM原代细胞异种移植的免疫缺陷小鼠模型.
关键词: 多发性骨髓瘤 原代细胞 NOD/SCID小鼠 异种移植模型 -
急性白血病甲氨蝶呤耐药及化疗个体化初探
研究表明,还原性叶酸载体(RFC)功能、甲氨蝶呤多聚谷氨酸(MTXPG)水平及二氢叶酸还原酶(DHFR)活性是影响甲氨蝶呤(MTX)疗效的三大主要原因[1].我们通过研究白血病患者原代细胞MTX耐药、个体差异机制,以期为MTX临床个体化、合理用药提供一点线索.
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髓系白血病原代细胞和肿瘤细胞株ATM转录水平的研究
共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasis,AT)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,以进行性中枢神经元变性、免疫缺陷、对放射线及其类似药敏感及患癌率高为特点.1995年Shilob确定AT为单基因遗传病,指出它是由于AT基因突变所致,并将此致病基因命名为ATM(AT mutated).在淋巴细胞白血病中,有ATM基因普遍存在缺失的报道,同时伴随ATM蛋白表达的降低和缺失[1-5].在髓系白血病中,ATM的表达率未见报道,为此,我们重点研究了ATM基因在髓系白血病中的表达谱情况.