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妊娠合并阵发性睡眠性血红蛋白尿一例及文献复习
阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)首次于1928年被报道,被认为是一种后天获得性红细胞膜缺陷引起的血管内溶血病。目前认为其为一种少见的造血干细胞克隆性疾病,以补体介导的血管内溶血为特征,合并造血功能衰竭、血栓倾向、肾功能不全和肺动脉高压等并发症。本疾病造血干细胞的PIG-A基因发生突变,导致糖磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidylinositol, GPI)锚磷脂合成障碍。GPI缺乏导致许多膜蛋白功能异常。其中,CD59和CD55补体调节蛋白不能连接于细胞膜,使红细胞对补体的敏感性增加,从而发生血管内溶血。此疾病发病率约为百万分之1-10,发病高峰年龄为20~40岁,男性明显多于女性。临床表现以间歇发作的睡眠后血红蛋白尿为特征,可伴有血栓形成倾向,并发感染和出血。实验室检查可见全血细胞减少和骨髓增生活跃,尤以红系造血旺盛。既往可以Ham试验、蔗糖溶血试验和蛇毒因子溶血试验阳性为诊断标准,随着技术的发展,目前利用特异性单克隆抗体通过流式细胞术检测外周血细胞GPI锚连接蛋白阴性细胞群体已作为诊断金标准。
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银屑病辨证分型与血小板凝血酶敏感蛋白及CD36分子表达的关系
近几年的研究表明,血小板活化可能在银屑病的发生与发展中起了重要作用.笔者采用流式细胞术和特异性单克隆抗体,对不同证型银屑病患者血小板凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin,TSP,又称P10)及CD36(Ⅳ)分子的表达进行了定量研究,旨在为本病中医辨证分型提供客观指标,更好地指导本病的辨证论治.
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应用转铁蛋白受体和胎儿血红蛋白标记染色方法分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究
由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少,Hahn, Holzgreve[1]和Bianchi等[2]报道,孕妇每毫升外周血中仅有1~2个完整胎儿细胞.所以采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记,并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术,是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的佳手段[3].但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体,故不同学者选用的标记性抗体也有所不同.本研究采用荧光激活细胞分离技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS ),通过对孕妇外周血及未孕妇女外周血中转铁蛋白受体(transferrin receptor, CD71)单标记染色和胎儿血红蛋白(fetal haemoglobin,HbF)单标记染色与双标记染色情况的比较,探讨CD71 与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值.
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达克宁在细胞克隆技术中的应用
能否有效地控制分泌特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞的污染,是该项研究中常遇到的问题,由于细菌耐药性的产生,传统应用双抗处理的方法多难于奏效.在杂交瘤细胞融合培养过程中,有时会发生真菌污染的现象.为防止和清除真菌污染,除了严格控制操作,还可采用小鼠腹腔和使用抗真菌药物的方法.目前,国内抗真菌药物如制霉菌素对杂交瘤细胞的毒性较大,抑制真菌效果不理想.我们在实验研究过程中使用达克宁注射液(有效成份为咪康唑)挽救意外污染了真菌的杂交瘤细胞,取得了良好的效果.
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鸡胸腺细胞特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
人和小鼠淋巴细胞表面抗原的各种单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAbs)试剂商品化应用,为细胞免疫学研究与疾病诊断提供了有力工具,而对禽类细胞免疫学研究相对落后于人和哺乳动物的研究,原因之一是缺乏淋巴细胞表面抗原的各种McAbs试剂.为此,我们研制并建立了抗鸡胸腺细胞McAbs杂交瘤细胞株,为我国禽类免疫和免疫病理研究提供了重要手段.
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血小板配型:微柱凝胶免疫检测
临床血小板输血前进行的配型试验是检测病人血清中抗体与供者血小板抗原的相容性,筛选与病人血型相容的血小板.血小板细胞膜有3类同种异体抗原:ABO抗原、HLA-I类和血小板特异性抗原;ABO血型的相容性可由检测红细胞确定,检测HLA和血小板血型的方法都比较复杂,如血小板免疫荧光检测、ELISA、混合红细胞粘附分析,特异性单克隆抗体血小板抗原固定检测等.因为缺少简单、快速、准确的检测方法,临床常规至今不能进行血小板的HLA和血小板血型配型检测.与血小板血型有关的临床上较常见的疾病和征状:血小板输血无效症、胎儿和新生儿同种免疫血小板减少症、输血后血小板减少性紫癜等,对这些疾病预防、诊断和治疗都迫切需要能用于常规的血小板血型检测方法.应用本室创建的微柱凝胶免疫检测技术创新建立了简单、快速、可靠的血小板配型试验方法.
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P选择素凝集素样区和表皮生长因子样区的原核表达质粒构建
P选择素(P-selectin)作为血小板/内皮细胞活化分子及粘附受体,在早期炎症、血栓形成、肿瘤转移等发挥重要作用[1-5],已成为近年研究热点.然而有关P选择素分子表位结构与其功能关系研究将有助于进一步阐明P选择素生理、病理意义及其参与疾病发病机制的作用,进而为针对其临床特异性抗粘附治疗奠定基础.为此我们采用基因工程技术,成功地构建了P选择素分子表位片段,为制备上述表位特异性单克隆抗体,进一步探讨P选择素表位结构与其功能关系提供基础.
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支气管和肺泡灌洗液肺癌相关抗原检测86例分析
1997年3月至1998年9月,我院用多株肺癌特异性单克隆抗体和金标免疫斑点法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)的肺癌相关抗原(LCA),以探讨其对肺癌的诊断价值.
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检测胸水肺癌相关抗原对癌性胸腔积液的诊断价值
临床资料 一、研究对象 1.癌性组:男15例,女10例。年龄34~92岁,平均年龄60.92±16.23岁。其中腺癌16例,鳞癌2例,小细胞未分化癌2例,未分型5例。左侧胸腔积液9例,右侧胸腔积液16例。大量胸腔积液5例,中等量积液15例,少量胸腔积液5例。 2.对照组:男17例,女3例。年龄23~84岁,平均年龄54.10±18.05岁。左侧胸腔积液7例,右侧胸腔积液13例。大量胸腔积液3例,中等量积液12例,少量积液5例。所有20例患者均为结核性渗出性胸膜炎,均按结核性胸膜炎治疗后缓解出院。 二、研究方法 根据入院后胸水细胞学检查、胸膜活检、经纤维支气管镜对支气管及肺部病灶的活检或锁骨上窝肿大淋巴结活检的结果,将45例患者分为癌性组和对照组。对所有患者的胸水用上海肿瘤研究所提供的包括肺小细胞癌、腺癌、鳞癌等多株肺癌特异性单克隆抗体,按说明书介绍的金标免疫斑点法检测胸液中的LCA。以斑点反应板上的固相抗体与胸水标本中的LCA结合成复合物,胶体金标记的另一组抗体再与复合物结合,形成肉眼可见的红色圆斑为阳性。未形成红色圆斑者为阴性。根据胸水LCA的检测结果,分别对恶性胸腔积液诊断的敏感性、特异性和正确性进行分析。 敏感性(%)=(真阳性数)/(真阳性数+假阴性数)×100% 特异性(%)=(真阴性数)/(真阴性数+假阳性数)×100% 正确性(%)=(真阳性数)/(真阳性数+假阳性数)×100% 三、结果 癌性组LCA阳性21例,假阴性4例。对照组LCA阴性18例,假阳性2例。以LCA阳性作为癌性胸腔积液的诊断标准,敏感性为84%,特异性为90%,正确性为91.3%。讨论 恶性肿瘤的胸膜转移为产生癌性胸腔积液的原因之一,故可用特异性肺癌抗体测定胸水中脱落的肿瘤细胞的相应抗原来诊断癌性胸腔积液。本研究结果显示用多株肺癌特异性单克隆抗体与金标免疫斑点法检测胸水LCA对癌性胸腔积液的诊断具有较高的敏感性、特异性和正确性。由于有10%的假阳性结果,因此,LCA阳性不能作为诊断癌性胸腔积液可靠的诊断依据。若与患者的临床情况相结合,则LCA阳性对癌性胸腔积液有很高的辅助诊断价值。
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黄河教授团队研究项目荣获2015年国家科技进步二等奖
在儿童及35岁以下成人恶性肿瘤中,白血病等血液系统恶性疾病所致的死亡率位居第一。异基因造血干细胞移植是恶性血液病等70余种疾病的唯一根治手段,但全球新数据显示,移植患者3年存活率仍徘徊在40%~50%。移植后复发、移植物抗宿主病和干细胞供者来源匮乏是目前全球移植领域具有挑战和急需解决的难题。针对上述关键问题,浙江大学医学院黄河教授主持的“异基因造血干细胞移植关键技术创新与推广应用”项目历经十年系列研究,取得下列创新性成果:①阐明移植后复发新机制并建立防治新策略。首次提出并证明在移植后复发中存在关键功能基因突变和白血病细胞克隆演变,揭示免疫逃逸关键靶点;建立移植后复发的术前风险分层,针对中、高危患者创立预防与抢先治疗免疫干预技术;创建符合国情的慢性粒细胞白血病移植分层治疗新方案,有效减少移植后复发,74%患者实现治愈,避免终身服药。②创建移植物抗宿主病( GVHD)预警与诊治新体系。团队率先在大样本的中国移植患者中,系统性研究关键非人类白细胞抗原基因多态性与GVHD关系,首次揭示高风险基因型,创建适合中国人的GVHD 移植前风险分层体系;创建急性GVHD早期、无创性诊断新模式;创立适合中国人群的GVHD预防新方案,针对致死率极高的糖皮质激素耐药的重度急性GVHD采用细胞因子联合阻断治疗新方案。③建立造血干细胞来源及干细胞应用新技术。创立亲缘人类白细胞抗原半相合造血干细胞移植优化新方案,患者5年存活率达60畅8%;建立骨髓间充质干细胞( MSC)临床应用技术平台,制备具有自主知识产权的人骨髓MSC特异性单克隆抗体,创立快速、高效富集MSC 技术体系,在此基础上建立骨髓MSC治疗慢性广泛型GVHD的细胞治疗方案。
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不同免疫接种方法在单克隆抗体制备中的应用及比较
在制备抗泡球蚴原头节可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞时,我们采用常规的小鼠腹腔免疫接种-脾淋巴细胞法(以下称腹腔免疫法)和后肢跖部局部免疫接种-胴淋巴结淋巴细胞法(以下称后肢跖部法),进行了4次杂交瘤细胞融合。经ELISA筛选和有限稀释克隆,后获得了16株可以稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。现将这两种免疫接种方法的结果及所获得的单克隆抗体的特性分析报告如下。1 材料和方法1.1 泡球蚴可溶性抗原手术摘取在沙鼠腹腔人工接种培养1年以上的泡球蚴包囊,在事先盛有生理盐水的培养皿中,粗铁纱网破碎过滤,沉淀用生理盐水悬浮清洗3遍后,在解剖镜下,仔细将位于中央的原头节收集,注意不要混入位于周围的大量石灰小体。取1.5×106个原头节,用pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)漂洗2遍后,再冻融2次。将原头节混悬液与等容的50mM n-heptyl-β-D-thioglucoside(含0.5mM PMSF)混合,超声粉碎后,10000g×4℃离心1h。上清即为泡球蚴可溶性抗原。以Bradford法测定蛋白浓度后,用PBS调整为10mg/ml,分装冻存。1.2 单克隆抗体的制备1.2.1 腹腔免疫接种-脾淋巴细胞法 50μg以1ml PBS稀释的泡球蚴原头节可溶性抗原,与等容福氏完全佐剂充分乳化后,腹腔注射BALB/c小鼠。14天后,换用福氏不全佐剂同法加强免疫。2周后,再次以1mlPBS稀释的100μg抗原腹腔注射强化免疫。3天后,检测血清抗体滴度,手术摘取ELISA结果OD值超过1.0小鼠的脾脏,采取脾淋巴细胞后,与P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合[1]。
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"一肾一夹"高血压大鼠下丘脑钠泵α亚单位的基因表达
目的:拟探讨"一肾一夹(1K1C)"高血压大鼠下丘脑(对水盐代谢的调节起着重要的作用)钠泵α亚单位(催化亚单位)各异构体基因表达的改变,为高血压发病机制的深入研究提供理论及实验依据.方法:选择雄性Sprague-Dawley大鼠制备1K1C高血压模型,设立假手术对照组,术后4周处死动物采集下丘脑,进行以下实验:(1)应用相应计算机软件,设计并合成针对钠泵α1、α2、α3亚单位及G3PDH(内参照)的4对特异性引物,应用分子生物学RT-PCR及图像分析方法探讨1K1C高血压大鼠及假手术组下丘脑钠泵α1、α2及α3亚单位mRNA水平的改变;(2)应用针对钠泵三种α亚单位的特异性单克隆抗体及免疫组化技术,在蛋白水平探讨该模型及假手术组下丘脑钠泵α1、α2及α3亚单位基因表达的改变.结果:术后四周1K1C大鼠血压明显升高(与术前比较,164.7±16.9 mmHg vs 104.3±12.3 mmHg, P<0.001),而假手术组大鼠血压变化不明显.与假手术组比较,无论在mRNA或蛋白水平,1K1C高血压大鼠下丘脑钠泵α3亚单位表达均减弱,而α1与α2亚单位表达无改变.结论:1K1C高血压大鼠作为高血压研究的重要模型之一,水盐平衡紊乱及血容量扩张是其血压升高的主要原因,而细胞膜上钠泵(Na+-K+-ATP酶)对水盐代谢的调节及机体的多种生理与病理过程起着重要的作用,与多种疾病的发生有关.引起1K1C高血压大鼠钠泵α亚单位基因表达异常改变的分子生物学机制可能是因为该模型体内存在着明显的水盐代谢紊乱以及血浆血管紧张素Ⅱ、醛固酮等体液因素的改变.钠泵α亚单位基因表达的改变可能具有重要的病理意义,研究表明,钠泵α亚单位各异构体与Na+、K+等离子以及强心甙类物质的亲和力不同,其功能各异,因此,这种基因表达的改变可能会直接或间接地引起相关组织细胞生物学效应的改变,并参与了高血压的发病机制.
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变态反应性疾病外周血嗜碱性粒细胞及中性粒细胞特异性激活标志物研究进展
变态反应性疾病是严重影响人类健康的常见病、多发病,包括哮喘、过敏性鼻炎、过敏性紫癜、荨麻疹、过敏性休克等.多种炎症性细胞参与了变态反应的发生发展.嗜碱性粒细胞特异性激活标志物为嗜碱性粒细胞特异性单克隆抗体2D7及BB-1.中性粒细胞的特异性激活标志物为中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、中性粒细胞髓过氧化物酶(myedloperoxidase,MPO)及乳铁蛋白(lactoferrin,LF).在患者痰液、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、血清及尿中可查出这些标志物升高.通过对这些标志物的评价,有利于控制哮喘等变态反应性疾病症状并进行合理的治疗.本文将对嗜碱性粒细胞和中性粒细胞标志物在变态反应性疾病中的研究进展逐一进行总结.
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结直肠癌的分子治疗
结直肠癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一,发病率和死亡率逐年呈上升趋势.患者就诊时大多处于中晚期,部分患者失去手术治疗机会,部分患者术后很快发生复发或转移,对这部分患者目前尚无有效的治疗方法.随着现代分子生物学技术的飞速发展,有关结直肠癌分子生物学的发病机制的研究日益深入,分子治疗策略显示出极大的前景.特异性单克隆抗体-表皮生长因子受体(ERGF)抑制剂西妥昔单抗.
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免疫磁技术在分离人外周血树突状细胞中的应用
免疫磁珠技术(Immuno-magnetic bead metho d,IMBM)是70年代起步,80年代兴起的,在国内、外应用较多的一种新型细胞分离技术.该项技术以免疫学为基础,渗透到病理学等各个领域,应用日趋广泛.尤其是在细胞分离等方面取得巨大进展.本文就IMBM及其在树突状细胞(dendritic c ell简称DC)分离纯化中的应用进行简单介绍.一、IMBM简介:1.免疫磁珠是一种直径数微米、大小均匀的球形结构,由三部构成. 其核心是金属小颗粒铁;核心周围均匀地包裹着一层高分子材料,可防止金属微粒漏出;外层为功能团,可结合特异性单克隆抗体.2.该技术的功能原理是:其表面被覆的特异性单克隆抗体或第二抗体可分别与特异性靶细胞结合,形成磁珠-抗体-抗原复合物;再用磁铁吸引复合物,使之与其他物质相分离.当磁珠-抗体-抗原复合物离开磁场,靶细胞得以收集.3.该分离方法可分为直接法和间接法;两种方法又均可存在阳性选择或阴性选择两种方式.二、IMBM在人外周血树突状细胞分离中的应用:DC具有呈递抗原,参与机体肿瘤免疫的重要作用,但其在外周血液中的含量仅占1%.用常规分离方法获取DC十分繁琐,耗时长、收获少、纯度低,且对细胞的损伤也较大.我室将IMBM应用于人外周血DC的分离 ,获得较好效果,现简介如下:首先用Ficoll密度梯度离心技术从人外周血中获得单个核细胞,再通过二步来分离DC.第一步:用标记的CD3、CD11b、CD16的混合性抗体与单个核细胞共孵育;清洗,然后再与磁珠标记的抗半抗原抗体共孵育.孵育后的细胞悬液在通过磁场时,磁珠标记的CD3+、CD11b+、CD16+的细胞则被吸附在阴性选择柱中,而未与磁珠标记的抗体相结合的细胞从磁场中流出被收集,即为富含DC的细胞悬液.第二步:将富含DC的细胞悬液与磁珠标记的CD4单克隆抗体共孵育 .则CD4+ DC在通过磁场时被吸附,从而使之被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,从而使被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,荧光抗体检验DC纯度为95%.三、讨论:在细胞分离时,应尽量使用人新鲜抗凝血,整个操作过程动作要轻柔.与磁珠标记的抗体孵育时间和温度可根据细胞数量的多少适当调整;孵育过程中,要不断地轻轻地摇动,以使细胞与抗体充分结合;冲洗细胞时,离心的速度和时间不宜过快和过长.细胞过柱前要用300目的尼龙网过滤,以免分离柱被成团细胞阻塞,影响分离效果.
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汉滩病毒感染成龄鼠模型用于特异性单克隆抗体保护作用的研究
目的 建立汉滩病毒感染成龄鼠的模型,以进行mAb的保护实 验. 方法 将7~8 wk BALB/c小鼠于感染病毒前1 d及感染后1 d, 2 d和4 d ,分别经腹腔注射环磷酰胺65 mg*kg-1 ,总剂量为260 mg*kg-1,观察其发病及死亡情况,并检测其体内不同脏器中 汉滩病毒 抗原的分布及滴度. 用mAb对上述感染小鼠进行保护实验. 结果 经环磷酰 胺处理的成龄鼠 ,由汉滩病毒隐性感染变为急性致死性感染(死亡率达100%). 其发病症状与汉滩病毒感染的 乳鼠类似,平均发病与死亡时间较感染乳鼠晚2~3 d, 且较为规律和集中. 汉滩病毒抗原在 感染的成龄鼠和乳鼠体内的分布及滴度基本相同. 用mA b对感染的成龄鼠和乳鼠分别进行保护实验,结果完全一致. 结论 经环磷 酰胺处理的成龄鼠,可作为汉滩病毒和HFRS研究用的动物模型.
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柯萨奇B病毒单克隆抗体与病毒性心肌炎
病毒性心肌炎是小儿常见的心血管疾病之一,严重危害儿童的身体健康.多年来各国学者对本病的病原学、发病机理及治疗等方面进行了大量研究.尤其是1975年Kohler和Milstein创建了生产特异性单克隆抗体的方法以来,许多学者将这一技术应用于心肌炎的各项研究中.本文综述近年来柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus B,CVB)单克隆抗体(Monoclonal antibodies,mAb)在病毒性心肌炎基础研究及临床应用研究方面的进展.