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极小胚胎样干细胞分离技术的探讨及临床应用前景
极小胚胎样干细胞(very small embryonic?like stem cells, VSEL)是一种非造血干细胞,其形态学和细胞标志与胚胎干细胞有相似之处,具有胚胎干细胞多分化潜能特性,可以向包括心肌和血管内皮细胞在内的三个胚层的细胞分化,且无免疫排异,并能改善急性心肌梗死后的心功能和心脏重构[1?5]。
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肝纤维化的药物治疗
0引言慢乙肝反复发作,经久不愈,可转变为肝纤维化.而肝纤维化又是肝硬变的早期和必经阶段,据有关报道,25-40%的肝纤维化患者,终发展为肝硬变.随着分子生物学和肝细胞分离技术的进步,近年来,对肝纤维化发生、发展的认识不断深化,并经证实肝纤维化可以逆转,早期的治疗不仅可以逆转肝纤维化,而且可有效的防止肝硬化的发生.根据肝纤维化的发生、发展特点,针对肝细胞外基质(ECM)的沉积增加,降解减少因素,制定出抑制ECM的生成,加速其降解的有效治疗措施[1-8],可望能逆转肝纤维化的病理进程.然而,目前尚乏高效、无明显毒副作用的药物,肝纤维化的治疗仍采取中西药结合.
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成年小鼠心房肌细胞分离方法的改进及钾电流记录
目的:建立稳定、重复性好的小鼠心房肌细胞分离技术,观察小鼠心房肌细胞形态以及钾通道电流特性,为进一步研究小鼠心房肌细胞的电生理特性打下基础。
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应用转铁蛋白受体和胎儿血红蛋白标记染色方法分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究
由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少,Hahn, Holzgreve[1]和Bianchi等[2]报道,孕妇每毫升外周血中仅有1~2个完整胎儿细胞.所以采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记,并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术,是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的佳手段[3].但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体,故不同学者选用的标记性抗体也有所不同.本研究采用荧光激活细胞分离技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS ),通过对孕妇外周血及未孕妇女外周血中转铁蛋白受体(transferrin receptor, CD71)单标记染色和胎儿血红蛋白(fetal haemoglobin,HbF)单标记染色与双标记染色情况的比较,探讨CD71 与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值.
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简单快速扩增获取γδT细胞的方法
近年来的研究发现, γδT细胞在机体的抗感染、抗肿瘤及免疫调节等方面具有重要作用.过去用流式细胞仪或磁性细胞分离技术来分离γδT细胞,不仅需要大量的外周血,而且所需仪器设备昂贵,操作复杂.我们用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)刺激外周血淋巴细胞进行快速扩增,结果短期内可获得大量的γδT细胞,现介绍如下.
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提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法
背景:由于小鼠肝脏小、血管较细,其原代肝星状细胞分离的难度相对较大,且得率有限,难以满足体外实验需求.目的:建立小鼠原代肝星状细胞高效稳定的分离方法,提高小鼠原代肝星状细胞的得率与纯度,为研究肝纤维化的机制奠定实验基础.方法:取成年雄性C57BL/6小鼠,以无钙镁离子的前灌流液经门静脉充分灌注肝脏,再先后以1 g/L链霉蛋白酶和0.7 g/LⅣ型胶原酶灌注,使用Nycodenz进行梯度密度离心,获取中间层原代肝星状细胞,锥虫蓝染法观察肝星状细胞活力,流式细胞法检测细胞纯度,免疫荧光法检测Desmin表达,并于倒置显微镜下观察细胞培养3,5,7 d后的形态变化,PCR法检测培养3,5,7 d后α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因表达情况.结果与结论:①每只小鼠肝脏可获得肝星状细胞(5.5±0.4)×106个,锥虫蓝检测细胞活力均大于95%,流式细胞法检测细胞纯度为94%,免疫荧光检测细胞高表达Desmin;②随着体外培养时间的延长,可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星型发展;③随培养天数增长,α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高;④结果提示,实验成功建立了高效分离小鼠肝星状细胞的方法,可为获得高纯度、高细胞活力的小鼠原代肝星状细胞提供技术方案,也为肝纤维化的机制研究提供技术保障.
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大鼠肝星状细胞简便分离法及鉴定
目的:介绍一种简便、经济、稳定的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)分离方法,为肝纤维化的研究提供细胞模型.方法:取符合标准的雄性SD大鼠,体重约400~450 g,行肝脏门静脉插管,灌洗肝脏后,先后采用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNA酶Ⅰ灌注,消化肝脏制成细胞悬液,20%Nycodenz密度梯度离心分离得到原代HSC Desmin及α-SMA抗体免疫组化鉴定纯度.结果:HSC得率2×107/每肝,细胞存活率及纯度达95%以上.结论:该法简便、经济,细胞得率和纯度稳定,是一种实用的大鼠HSC分离方法.
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142.组织干细胞
1.定义组织按相应的分化阶段分为①干细胞(stem cells);②前体细胞(progenitor cells/transit amplifying cells);③成熟细胞(mature cells)三类.组织干细胞或称躯体性干细胞,既有多分化能力,也保持未分化性的胚胎性干细胞特征.干细胞具有多分化能力的同时,也具有干细胞产生干细胞的自我复制能力.这样的由干细胞系统产生的细胞群有血细胞、皮肤表皮细胞、消化道黏膜细胞、睾丸生殖细胞等.干细胞占构成组织的全体细胞的比例很低,例如造血干细胞仅以有核细胞的1/100000的低比率存在.但是,利用多种单克隆抗体和干细胞特有的药剂排泄活性、荧光细胞分离技术(FACS),使分离干细胞成为可能.干细胞的细胞转化周期非常慢,该集团中一部分细胞进入细胞周期后,区别于前体细胞可显示出高的增殖能力.明确什么刺激使干细胞开始增殖、分化、子细胞的不均等分裂,或自我复制(birth)和细胞分化(death)两个不同的方向是由怎样的机制产生的是今后的课题.
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免疫磁珠技术在分离人外周血树突状细胞中的应用
近年来细胞分离技术的发展十分迅速,分离主要根据各种细胞的不同的物理性状及表面受体或抗原的差异而采取不同的分离技术。免疫磁珠(Immunomag-netic bead, IMB)技术是由20世纪70年代起步,80年代兴起的国内外应用较多的一种新技术。……
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基底加载时波形及应变幅度对细胞生长、增殖与铺展的影响
细胞力学的研究是近几年来生物力学领域中迅速发展起来的一个前沿课题,过去几十年集中于红细胞,近几年研究重点转向白细胞、血小板、成骨细胞、血管内皮细胞、动脉平滑肌细胞、心肌细胞、癌细胞及多种细胞的相互作用.近年来,随着细胞分离技术和培养技术的成熟,实验手段不断更新,理论上也有了新的发展.
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汉防己甲素抗肝纤维化研究进展
汉防己甲素(Tetrandrine; Tet)是从防己科千金藤属植物粉防己(stephania tetrandra smorre)的块根中分离的主要生物碱,其分子式为C33H42N2O6,化学结构属双苄基异喹啉类.药理研究证实,Tet是一种钙离子拮抗剂,主要作用于钙离子通道,影响钙离子的跨膜转运及在细胞内的分布利用.近年来,随着肝脏细胞分离技术及分子生物学的进步,Tet抗肝纤维化的研究已深入到细胞、亚细胞及分子水平.
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一种简便的大鼠肝脏星状细胞分离培养方法及鉴定
目的 探索简单经济的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)分离培养方法,提高实验效率.方法 取SD大鼠,行肝脏门静脉插管,用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶灌注,消化.细胞悬液经Percoll密度梯度离心液分离,台盼蓝染色鉴定细胞活性,Desmin抗体免疫组化鉴定纯度.结果 HSCs得率为(2.35±0.15)×107/每肝,细胞活率为(95.5±0.6)%,纯度为(92.4±1.5)%.结论 该法有效简化了大鼠HSCs提取的方法,有利于原代大鼠HSCs的生物学研究.
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肿瘤干细胞与肿瘤微环境的相互作用
Reya等于2001年提出了“肿瘤干细胞学说”,认为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是在肿瘤组织中存在的小部分有正常干细胞样的特点,能自我更新(self-renewal)、增殖分化(differentiation)的细胞亚群,其通过不均匀分裂(asymmetric division,ASD)方式形成两个细胞,一个维持未分化的状态,作为肿瘤干细胞保留下来;另一个分化成不同表型的肿瘤细胞.2002年,Clarke等应用荧光活化细胞分离技术(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS)首次从乳腺癌中分离出CSCs.随着研究的不断深入,目前已经在多种高级别原发脑肿瘤(胶质瘤、髓母细胞瘤和室管膜瘤)和神经母细胞瘤中也分离出CSCs.CSCs具有自我更新性,在无血清培养基中成球生长,表达干细胞标记物和具有多谱系分化潜能等特点.
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三种人脐静脉内皮细胞分离方法的比较
目的建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离和培养的方法.方法分别采取"灌注消化法"、"机械刮取法"和"灌注搓揉法"来分离HUVECs.通过苔盼蓝排斥法检测细胞活力并计数,进行免疫荧光法鉴定,比较这3种方法在获取的细胞数目、细胞活力和纯度方面的差异.常规进行细胞的原代培养和传代培养.取第3代培养细胞绘制细胞生长曲线,根据细胞生长特点,形态及表型特征对培养细胞进行鉴定.结果 "灌注搓揉法"所分离的细胞无论从细胞数目、细胞活力和纯度方面均优于传统的"灌注消化法"和"机械刮取法".培养的细胞从形态、生长特点和表型鉴定证实为血管内皮细胞(ECs).结论 "灌注搓揉法"是一种获取血管ECs成功率高,可靠的方法.
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小鼠脑血管内皮细胞的分离和培养
目的探讨鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行形态学和功能学的研究.方法取新生小鼠脑组织,采用胶原酶消化、差速离心、滤过分离等技术,进行原代培养;待细胞贴满瓶底时,进行传代培养.取原代和传代细胞各6孔,吸取培养上清液,用放免法和化学法测定ET和NO的含量.结果经ⅧF:Ag免疫组化和细胞形态鉴定,证明培养的是血管内皮细胞,并且培养的脑微血管内皮细胞能合成和分泌ET和NO.结论采用胶原酶消化、差速离心、滤过分离等技术是获取内皮细胞的可靠方法,这为脑血管疾病的研究提供有用工具.
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细胞外基质与肝纤维化
肝纤维化(liver fibrosis,LF)是指肝脏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)特别是胶原在肝内的过度沉积,是慢性肝病所共有的病理改变,也是肝硬变(live cirrhosis)的必经阶段,被视为肝硬变的前奏.ECM是位于机体细胞外的非细胞性的有形及无定形间质成分.既往人们在研究慢性肝病进展为肝硬化时往往只注重细胞内成分及改变,对组织细胞的影响和作用重视不够.现今随着分子生物学和肝细胞分离技术的进步,人们逐渐认识到ECM不只是对细胞与组织起支架或骨架作用,而且对生理或病理状态下细胞的分化、增殖、代谢、运动及其基因表达均有非常重要的作用,并正在成为研究热点[1].本文拟就ECM在LF形成中的作用及其在LF诊断与治疗方面的应用作一概述.
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豚鼠听毛细胞耳蜗灌注分离法初步探讨
Katsuki和Covell(1953)首次用机械分离法从豚鼠耳蜗中分离出有活性的外毛细胞.Zenner等和Brownell等(1985)完善和发展了毛细胞分离技术,并被广泛采用.Brewnell等先用木瓜蛋白酶加机械分离,后来仅用钝性分离和单纯吹打法.Zenner等用尖端直径为4~40 μm的玻璃毛细管通过显微操纵器,插入Corti隧道直接分离毛细胞.现将我们用的一种新的毛细胞分离方法--耳蜗灌注法,介绍如下.
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免疫磁技术在分离人外周血树突状细胞中的应用
免疫磁珠技术(Immuno-magnetic bead metho d,IMBM)是70年代起步,80年代兴起的,在国内、外应用较多的一种新型细胞分离技术.该项技术以免疫学为基础,渗透到病理学等各个领域,应用日趋广泛.尤其是在细胞分离等方面取得巨大进展.本文就IMBM及其在树突状细胞(dendritic c ell简称DC)分离纯化中的应用进行简单介绍.一、IMBM简介:1.免疫磁珠是一种直径数微米、大小均匀的球形结构,由三部构成. 其核心是金属小颗粒铁;核心周围均匀地包裹着一层高分子材料,可防止金属微粒漏出;外层为功能团,可结合特异性单克隆抗体.2.该技术的功能原理是:其表面被覆的特异性单克隆抗体或第二抗体可分别与特异性靶细胞结合,形成磁珠-抗体-抗原复合物;再用磁铁吸引复合物,使之与其他物质相分离.当磁珠-抗体-抗原复合物离开磁场,靶细胞得以收集.3.该分离方法可分为直接法和间接法;两种方法又均可存在阳性选择或阴性选择两种方式.二、IMBM在人外周血树突状细胞分离中的应用:DC具有呈递抗原,参与机体肿瘤免疫的重要作用,但其在外周血液中的含量仅占1%.用常规分离方法获取DC十分繁琐,耗时长、收获少、纯度低,且对细胞的损伤也较大.我室将IMBM应用于人外周血DC的分离 ,获得较好效果,现简介如下:首先用Ficoll密度梯度离心技术从人外周血中获得单个核细胞,再通过二步来分离DC.第一步:用标记的CD3、CD11b、CD16的混合性抗体与单个核细胞共孵育;清洗,然后再与磁珠标记的抗半抗原抗体共孵育.孵育后的细胞悬液在通过磁场时,磁珠标记的CD3+、CD11b+、CD16+的细胞则被吸附在阴性选择柱中,而未与磁珠标记的抗体相结合的细胞从磁场中流出被收集,即为富含DC的细胞悬液.第二步:将富含DC的细胞悬液与磁珠标记的CD4单克隆抗体共孵育 .则CD4+ DC在通过磁场时被吸附,从而使之被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,从而使被收集到阳性选择柱中.将分离柱移离磁场,冲出柱内细胞,清洗后,荧光抗体检验DC纯度为95%.三、讨论:在细胞分离时,应尽量使用人新鲜抗凝血,整个操作过程动作要轻柔.与磁珠标记的抗体孵育时间和温度可根据细胞数量的多少适当调整;孵育过程中,要不断地轻轻地摇动,以使细胞与抗体充分结合;冲洗细胞时,离心的速度和时间不宜过快和过长.细胞过柱前要用300目的尼龙网过滤,以免分离柱被成团细胞阻塞,影响分离效果.
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采用探针D13S319和D13S25检测多发性骨髓瘤13q14缺失
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是以骨髓中克隆性浆细胞恶性增殖和异常积聚为特征的肿瘤.核型异常是MM主要的预后因素之一,13q14缺失是常见的一种染色体异常[1,2].间期荧光原位杂交(interphase fluorescence in situ hybridization,I-FISH)技术的应用不受细胞分裂相的影响,高纯度细胞分离技术之一的磁珠分选系统(magnetic activated cell sorting,MACS)富积了骨髓瘤细胞,因而二者结合大大提高了MM核型异常的检出率.我们应用该两项技术,采用位于13q14的序列特异性DNA探针D13S319和D13S25,对42例初治MM患者的13q14缺失进行了检测分析.
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自体外周血造血干细胞移植治疗非霍杰金淋巴瘤1例
造血干细胞移植(HSCT)泛指在患者接受超剂量化/放疗后将各种来源的正常造血干细胞通过静脉输注移植入受者体内,以替代原有的病理性造血干细胞,清除体内的恶性或异常细胞克隆,从而使正常的造血与免疫功能得以重建,并达到治疗疾病的目的.HSCT在国内外广泛应用于治疗恶性血液病、恶性实体瘤、部分非恶性难治性血液病,随着细胞因子的普及、干细胞分离技术的不断改进、免疫抑制剂作用的提高,HSCT的治疗技术不断成熟,疗效不断提高,甚至成为治愈某些疾病的唯一方法.