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SV40(Simain Virus 40)的分子生物学研究进展
SV40(Simain Virus 40)是猿猴的病毒,但与多种人类肿瘤关系密切,因此引起人们的重视.SV40基因组较小,广泛的用于载体构建和细胞转化的研究.对于SV40的分子生物学特性及其与人类肿瘤的关系还在进一步研究中,本文就此综述了国内外相关的研究进展.
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没食子酰表没食子儿茶素对TPA促癌的抑制作用
目的从绿茶中提取的多酚成分,具有很强的抗氧化作用.没食子酰表没食子儿茶素(EGCG)是该提取物的主要成分.本实验旨在证明EGCG对TPA的促癌作用具有抑制效应.方法采用BALB/3T3细胞转化试验、诱导小鼠耳部炎性水肿试验和小鼠背部皮肤增生试验,以观察EGCG对TPA的抑制作用.结果体外试验,EGCG具有抑制TPA的促细胞转化作用;在整体实验,EGCG可以抑制TPA诱导的小鼠耳部水肿.其大抑制率为43.51%;EGCG对TPA所诱导的小鼠背部皮肤增生的大抑制率为46.60%.结论 EGCG对癌症的预防具有某些实用价值.
关键词： 没食子酰表没食子儿茶素 TPA 细胞转化 抑制促癌 -
有丝分裂关卡功能下降在中国仓鼠肺细胞恶性转化过程中的作用
目的观察中国仓鼠肺细胞(CHL)在经化学致癌物恶性转化后的染色体不稳定性、有丝分裂关卡功能和对秋水仙素细胞毒性的抗性.方法 CHL细胞在经甲基硝基亚硝基胍(MNNG)恶性转化后,进行核型分析,以秋水仙素诱导细胞停滞于有丝分裂中期的比例反映有丝分裂关卡功能,MTT法检测秋水仙素的细胞毒性.结果细胞经2 μg/ml MNNG处理24 h,3周后出现明显的形态转化,而且软琼脂集落形成率(54.2%)明显高于对照细胞(10%),表明处理细胞已恶性转化;核型分析显示转化细胞的染色体数目在14～48之间,只有7%的细胞有25条染色体;而对照细胞81%有25条染色体,表明转化细胞染色体(数目)不稳定性;以0.5 μg/ml秋水仙素处理转化和对照CHL细胞不同时间,计数细胞有丝分裂中期相细胞比例,可见在各时间点,转化细胞的中期相细胞比例都低于相应的对照细胞, 这表明转化细胞的有丝分裂关卡功能下降;以不同浓度秋山仙素处理转化和对照细胞24 h,可见各浓度组转化细胞生存率明显高于对照细胞,这显示恶性转化细胞具有明显的秋水仙素毒性抗性.结论有丝分裂关卡功能下降可能在细胞的恶性转化过程中有重要作用.
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镉应答新基因TEF-1δ的生物学功能研究
目的探讨镉应答新基因TEF-1δ在细胞转化和致癌过程中的重要作用.方法应用细胞转染、Western Blot以及细胞转化等技术与方法,对克隆化基因TEF-1δ的生物学功能进行研究.结果 TEF-1δ cDNA以pcDNA 3.1/V5-His-TOPO为表达载体所转染的CHO细胞和猴肾COS1细胞均可表达相对分子质量为31 000的TEF-1δ编码蛋白质,而非转染和单纯载体转染的对照细胞则无此蛋白质表达.进一步研究表明,TEF-1δ cDNA转染NIH3T3细胞可导致TEF-1δ蛋白质超额表达,并与细胞转化密切相关.结论镉的细胞转化和致癌作用至少部分因TEF-1δ基因的高表达所致.TEF-1δ可能是一个新发现的镉应答原癌基因.
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氯化镉在Balb/c 3T3细胞转化过程中对细胞凋亡的影响
目的 探讨氯化镉(CdCl2)在Balb/c 3T3细胞转化过程中对细胞凋亡的影响及其分子机制.方法 N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)启动后,CdCl2持续处理Balb/c 3T3细胞14 d,建立两阶段细胞转化模型.苔盼蓝排染法检测CdCl2的细胞毒性,Annexin V-HTC/PI双染色结合流式细胞仪检测细胞凋亡率,小鼠毒理基因芯片检测CdCl2促癌作用过程中的基因表达变化.结果 1 mg/L MNNG启动后,324 μg/L CdCl2持续处理能诱导细胞转化灶的出现.CdCl2处理2 d后细胞存活率降低,凋亡率显著升高.同时基因表达谱分析筛选出的差异表达基因中,有11个基因的功能与细胞凋亡有关,10个基因的功能与细胞抗氧化机制有关.结论 CdCl2在促癌过程能诱导Balb/c 3T3细胞凋亡,同时影响凋亡和抗氧化相关基因的表达.
关键词： 细胞凋亡 细胞转化 Balb/c 3T3细胞 氯化镉 基因芯片 -
佛波酯等3种促癌物诱导BALB/c 3T3细胞骨桥素基因表达升高
目的探讨促癌物佛波酯(12-O-tetradecanolylphorbol-13-acetate,TPA),岗田酸(Okadaic acid,OA)和氯化镉(Cadmium Chloride,CdCl2)在促进BALB/3T3细胞转化过程中对骨桥素基因(Osteopontin,OPN)转录表达的影响.
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蛋白磷酸酶2A的Aα亚基突变诱导人体细胞转化
目的以往的研究证明猿猴病毒40(simian virus40)编码的小T抗原(small t antigen,ST)能与细胞内蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的A亚基直接结合并抑制全酶的活力,ST的表达能诱导多种人原代细胞转化.人体肿瘤组织中可检测到PP2A Aα亚基单一染色体突变,而且部分肿瘤细胞株Aα亚基的表达水平降低.本研究的目的在于阐明Aa亚基突变是否改变酶的功能以及在诱导细胞转化中的作用及机制.
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1-03 塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因突变
目的了解药物致癌过程中的基因突变情况.方法利用以塞替派为致癌原诱导永生化人支管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化建立的癌前转化细胞(BEAS-TE)以及从软琼脂上筛选到了克隆化多倍体细胞,沿转化细胞代龄进行了转化进程中p53、p16和Ki-ras基因突变情况的动态观察.结果 p53、Ki-ras基因存在多位点、p16基因单位点的的碱基突变.结论 p53和Ki-ras基因的多位点突变是塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件,p16基因非编码区单个碱基的缺失是细胞转化过程中的次要分子事件.
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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5～8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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不同代谢活化系统增强苯并(a)芘诱导人支气管上皮细胞转化效应
目的 探讨不同的代谢活化系统在苯并(a)芘[B(a)P]诱导人细胞转化模型中的应用.方法 选择人支气管上皮细胞HBETR,采用3种不同的代谢活化方式:分别为加入大鼠S9组分(S9-Mix)、高表达代谢关键酶P450 CYP1A1(HBETR-1A1细胞)和染毒前48小时用低剂量B(a)P诱导(HBETR-IN细胞).通过软琼脂克隆形成试验和裸鼠皮下成瘤试验来比较在不同的代谢活化系统下,间接致癌物B(a)P诱导细胞转化的效能.结果 通过蛋白印迹和酶活性检测结果验证HBETR-1A1细胞构建成功.细胞的生物学特性没有明显的改变.20μmol/L B(a)P染毒作用下HBETR-1A1、HBETR-IN细胞出现转化时间均为11周,而未加入活化系统时,HBETR细胞需14周才能获得恶性转化.HBETR细胞在加入和不加入S9-Mix的条件下,转化时间分别是14周、20周.上述转化的效果与CYP1A1酶活性以及蛋白表达水平相一致.结论 三种代谢系统都能够促进间接致癌物B(a)P的代谢活化,缩短细胞的转化间期,提高细胞转化效率.从试验操作难度、试验的重复性及结果的可靠性等几个方面比较三种代谢系统应用的可行性,低剂量诱导作为新的代谢活化的方法在细胞转化试验中有着潜在的应用前景.
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端粒酶在石英致细胞恶性转化中的作用
目的观察在石英诱发人胚肺成纤维细胞恶性转化中端粒酶的作用.方法将端粒酶功能片段(hTERT)导入人胚肺成纤维细胞(HELF)中.经细胞毒性实验确定染毒剂量后,用石英粉尘(160μg/cm2)对导入/未导入hTERT的HELF进行染毒,分离转化灶,观察细胞生物性状,测定细胞生长曲线、端粒酶活性和端粒长度,进行软琼脂集落形成实验,判定转化性质.结果将hTERT成功地导入了人胚肺成纤维细胞系(HELF-T+),发现石英刺激后,导入端粒酶功能片段的人胚肺成纤维细胞的恶性转化率高于未导入端粒酶功能片段的人胚肺成纤维细胞(P＜0.05)且有较高的端粒酶活性和端粒长度.结论端粒酶在石英诱导细胞发生恶性转化的过程中发挥了重要作用.建立的端粒酶基因导入的细胞系可用于其它环境与职业危害因素相关疾病发病过程中的端粒酶作用的研究.
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Balb/c 3T3细胞体外转化实验及其在环境致癌物检测上的应用
Balb/c 3T3细胞体外转化实验是利用Balb/c 3T3细胞在体外培养的环境下,模拟致癌物在动物体内致瘤过程进行致癌物筛选的一种技术,它的检测终点是正常细胞转化为恶性细胞时获得的恶性表型.本文就其方法的发展和改进,以及其在肿瘤启动剂和促癌剂检测上的应用进行了综述.
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癌基因高表达人上皮细胞转化模型的构建及应用
目的 构建癌基因高表达人支气管上皮细胞模型并应用于致癌物诱导细胞恶性转化活性的检测.方法 在永生化人支气管上皮细胞株16HBE中依次导入人端粒酶催化亚基(hTERT)、癌基因H-RasV12或c-Myc或空白载体,构建细胞株16HBETR、16HBETM和16HBETV.检测所构建细胞株的生物学特性如细胞形态、细胞生长、染色体畸变等指标.用已知致癌物硫酸镍(NiSO4)和二氢二醇环氧苯并(a)芘(BPDE)多次染毒,利用软琼脂试验及荷瘤试验检测化学物诱导细胞转化的活性.结果 经过端粒酶活性测定以及蛋白印迹验证上述转基因16HBE细胞株均构建成功.癌基因H-Ras和c-Myc的表达分别使细胞的增殖加速30.3%和10.4%,但是细胞染色体的畸变率没有发生改变.癌基因高表达细胞株只在软琼脂中形成少数背景克隆,但不能在裸鼠皮下形成肿瘤.BPDE诱导16HBETR、16HBETM细胞发生恶性转化的间期分别为5周、11周,比对照组细胞16HBETV的20周分别提前了15周和9周;而硫酸镍诱导16HBETR、16HBETM细胞转化的间期分别为11周、14周.比对照组细胞的32周分别提前了21周和18周.结论 癌基因高表达的细胞转化模型可大大缩短试验间期,有望应用于环境致癌物的筛查及化学致癌机制的研究.
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结晶型硫化镍诱发细胞恶性转化过程中基因组总体DNA甲基化的改变
目的 探讨结晶型硫化镍(NiS)对体外培养细胞基因组总体DNA甲基化水平的影响.方法 分别以0.25、0.50、1.00、2.00 μg/cm2结晶型NiS处理人支气管上皮细胞系(16HBE)24 h,隔天再次进行相同处理,共处理3次;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理72 h的正常细胞为阳性对照.应用免疫荧光法和SssI甲基转移酶法定性、定量分析结晶型NiS处理细胞和恶性转化细胞(NSTC)基因组DNA总体甲基化的变化.结果 结晶型NiS处理细胞DNA甲基化免疫荧光的强度均有不同程度降低,转化细胞DNA甲基化免疫荧光的强度明显降低.定量分析结果显示,对照组基因组总体甲基化率(mCpG%)为(81.9±7.3)%,0.25、0.50、1.00、2.00 μg/cm2的结晶型NiS处理3次的细胞(NiS0.25、NiS0.50、NiS1.00、NiS2.00)基因组总体mCpG%则分别为(77.9±6.2)%、(75.3±6.8)%、(59.5±4.9)%、(67.4±5.1)%.经单因素方差分析显示,不同组间总体mCpG%差异有统计学意义(F=124.95,P＜0.01),两两比较发现NiS1.00和NiS2.00组与对照组相比,差异均有统计学意义(t值分别为7.64、4.89,P值均＜0.01);恶性转化细胞(NSTC1、NSTC2)基因组总体mCpG%分别为(46.2 ±4.1)%、(43.6±4.3)%,低于对照组,差异有统计学意义(t值分别为12.79、13.56,P值均＜0.01).结论 结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中,整体基因组DNA甲基化水平降低.
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miR-542-3p在反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导致癌中的作用
目的 探讨反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导恶变的人支气管上皮细胞(16HBE-T)中miR-542-3p在细胞恶性转化中的作用.方法 运用实时荧光定量PCR法验证miR-542-3p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)中的表达水平.瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平,检测miR-542-3p表达水平改变对16HBE-T细胞的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、软琼脂克隆形成率及细胞迁移能力的影响.结果 转染前16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是16HBE-N的(39.08±6.95)%(t=15.18,P＜0.05).瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平后,16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是转染前的(5.23±0.55)倍(t=17.37,P＜0.05).miR-542-3p模拟物组(mimic组)与16HBE-T组(100%)相比,增殖率下降到(62.06±5.61)%(t=-17.28,P＜0.05),G0/G1期比例上升到(74.76±4.86)%(t=4.53,P＜0.05),克隆形成率降低为(5.87±0.67)%(t=-6.66,P＜0.05).mimic组生长细胞覆盖区面积比(0.31±0.08)明显降低(t=-6.78,P＜0.05),凋亡无改变.结论 miR-542-3p表达水平升高会降低anti-BPDE恶性转化细胞的增殖能力和恶性程度,推断miR-542-3p是类抑癌基因,在anti-BPDE诱导致癌过程中低表达的miR-542-3p可能是促成恶性转化的重要因素.
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甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化研究
目的 研究潜在致癌化学物甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱发人支气管上皮细胞恶性转化的作用.方法 分别采用1、2、4、8μg/ml浓度的GMA多次处理人支气管上皮细胞(16HBE),连续动态地观察细胞形态学的改变,通过刀豆凝集素A(conA)试验、软琼脂集落形成试验、电镜扫描和裸鼠体内致瘤性试验观察细胞的恶性转化表型,并运用免疫化学方法对细胞和肿瘤组织来源特性进行鉴定.试验同时设二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组和三甲基胆蒽(MCA)阳性对照组.结果 1～8 μg/ml浓度范围的GMA多次攻击可使16HBE细胞发生恶性转化,转化率随染毒剂量的增加而升高,其中8μg/ml染毒组的转化率(8.48×10-6)与对照组(4.5×10-7)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞失去接触抑制呈交错重叠生长并能在软琼脂上形成集落,各剂量组的集落形成率随染毒剂量的增加而升高,其中2、4、8μg/ml染毒组的集落形成率分别为1.20‰、2.35‰和5.70‰,与溶剂对照组(0.30‰)相比差异有统计学意义(P<0.01).转化细胞对conA的凝集敏感性增加,扫描电镜下细胞表面微绒毛增多、变粗、变长.将转化细胞接种于裸鼠皮下可形成肿块,经病理组织学检查诊断为鳞状上皮细胞癌.16HBE细胞和肿块组织经免疫组织化学检测角蛋白呈阳性表达.结论GMA可在体外诱发16HBE细胞发生恶性转化.
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三种中药有效成分对转化的人胃黏膜上皮细胞的抑制作用
目的:明确三种中药有效成分三七皂甙(PNS)、黄芪皂甙(AS)及黄芩甙(Ba)单用或配伍对永生化的人胃黏膜上皮细胞GES-1以及经过幽门螺杆菌(HP)培养滤液转化后的GES-1细胞(HP细胞)增殖能力的影响.方法:以HP培养上清滤液作用GES-1细胞,通过描绘细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验检测细胞恶性转化程度.分别以不同浓度的三七皂甙、黄芪皂甙及黄芩甙处理两种细胞,四甲基谷氮唑盐(MTT)法及软琼脂集落形成试验检测三种药物单用及配伍对细胞增殖活性的影响.结果:HP滤液作用后的GES-1细胞增殖活性升高,软琼脂集落形成能力增强,但仍不能在裸鼠体内成瘤.PNS、AS及Ba对GES-1和HP细胞的增殖活性有明显的抑制作用,并有随剂量增加作用增强的趋势.三药配伍应用对两种细胞的抑制作用增强,还能明显抑制HP细胞的软琼脂集落形成能力.结论:HP滤液能促进GES-1细胞的进一步转化.三种药物有效成分显著抑制GES-1及HP细胞的增殖,三药配伍抑制作用有不同程度的增强.
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绵羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env构建及引起NIH3T3细胞恶性转化的研究
为了构建绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因真核表达质粒并观察绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在293T细胞中的定位情况以及探讨是否可诱导NIH3T3细胞发生恶性转化,本研究采用RT-PCR技术从自然感染绵羊肺腺瘤病的病羊肺组织中克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env),并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中.构建好真核表达质粒经PCR、酶切和测序鉴定.同时对exJSRV-env基因进行生物信息学分析.采用脂质体法将该重组质粒转染293T细胞,观察其在真核细胞中的表达及定位情况.将该重组质粒转染NIH3T3细胞,观察细胞是否发生恶性转化.用软琼脂集落实验检查转染重组质粒的NIH3T3细胞的生长状态.结果显示真核表达质粒构建成功并命名为pEGFP-C1/exJSRV-env.exJSRV囊膜蛋白的氨基酸序列与参考株比对发现该囊膜基因的跨膜区(TM区)的胞质尾区具有外源性病毒特有的YXXM基序.系统进化树也表明我们克隆的exJSRV-env基因属于致病性的外源性病毒.运用生物信息学技术分析env基因编码的蛋白质的基本性质,并预测其可能的结构.亚细胞定位表明exJSRV囊膜蛋白主要分布于细胞膜.转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒的NIH3T3细胞接触抑制性消失,可在软琼脂中形成集落.说明绵羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白可引起NIH3T3细胞发生恶性转化.研究结果为进一步探讨exJSRV囊膜蛋白的结构和功能及其致病机理提供了实验基础.
关键词： 外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因 囊膜蛋白 亚细胞定位 细胞转化 -
钙蛋白酶在乳腺上皮转化细胞对雌激素刺激反应中的作用
目的 探讨经雌激素(E2)转化的MCF-10A乳腺上皮细胞对E2刺激的敏感性及细胞内钙蛋白酶(CANP)在E2效应中的介导作用,以深入了解E2的信号传导机制.方法 以E2转化的MCF-10A乳腺上皮细胞为研究模型、用E2(50 nmol/L)刺激细胞,以蛋白印迹法观察蛋白分子质量变化,以CANP特异性底物局部黏着激酶(FAK)蛋白剪切作为CANP激活的指标,伤口愈合实验观察细胞迁移变化,CANP抑制剂预处理观察CANP在E2效应中的作用.结果 转化细胞CANP活性明显高于非转化细胞,表现为前者出现FAK明显蛋白剪切,而后者FAK主要为野生型(125 ku),同时转化细胞迁移明显增强(P＜0.01).E2(10 nmol/L)刺激转化细胞可进一步促进FAK蛋白剪切和细胞迁移(P＜0.01),而非转化细胞对E2刺激不敏感.CANP抑制剂-1(ALLN)可有效阻断E2刺激转化细胞FAK蛋白剪切及细胞迁移(P＜0.01).结论 转化细胞对E2刺激的敏感性增加,其机制可能与胞内CANP活性增强有关,提示在转化细胞存在活跃的E2-CANP-FAK信号活动.
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人良性胆管瘢痕成纤维细胞的培养和鉴定
成纤维细胞(fibroblast,Fb)过度增生是良性且日管瘢痕狭窄形成的主要原因[1]…;前期研究发现Fb在良性胆管瘢痕病变中可向肌成纤维细胞转化,并能表达凋亡相关因子如Sur-vivin、BCL-2、BAX等,以及血管生成相关冈子如VEGF等[2];而正常组织的成纤维细胞未见表达.
