首页 > 文献资料
-
绵羊肺腺瘤病毒pEGFP-C1/exJSRV-env构建及引起NIH3T3细胞恶性转化的研究
为了构建绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因真核表达质粒并观察绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在293T细胞中的定位情况以及探讨是否可诱导NIH3T3细胞发生恶性转化,本研究采用RT-PCR技术从自然感染绵羊肺腺瘤病的病羊肺组织中克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env),并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中.构建好真核表达质粒经PCR、酶切和测序鉴定.同时对exJSRV-env基因进行生物信息学分析.采用脂质体法将该重组质粒转染293T细胞,观察其在真核细胞中的表达及定位情况.将该重组质粒转染NIH3T3细胞,观察细胞是否发生恶性转化.用软琼脂集落实验检查转染重组质粒的NIH3T3细胞的生长状态.结果显示真核表达质粒构建成功并命名为pEGFP-C1/exJSRV-env.exJSRV囊膜蛋白的氨基酸序列与参考株比对发现该囊膜基因的跨膜区(TM区)的胞质尾区具有外源性病毒特有的YXXM基序.系统进化树也表明我们克隆的exJSRV-env基因属于致病性的外源性病毒.运用生物信息学技术分析env基因编码的蛋白质的基本性质,并预测其可能的结构.亚细胞定位表明exJSRV囊膜蛋白主要分布于细胞膜.转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒的NIH3T3细胞接触抑制性消失,可在软琼脂中形成集落.说明绵羊肺腺瘤病毒的囊膜蛋白可引起NIH3T3细胞发生恶性转化.研究结果为进一步探讨exJSRV囊膜蛋白的结构和功能及其致病机理提供了实验基础.
关键词： 外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因 囊膜蛋白 亚细胞定位 细胞转化 -
苜蓿尺蠖核型多角体病毒囊膜蛋白ODV-E18的核定向转运研究
苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)在细胞质中合成其囊膜蛋白,但在细胞核内组装并包埋病毒粒子,这些蛋白的核定向转运机制是人们甚感兴趣的课题.以AcMNPV多角体衍生型病毒ODV(occlusion-derived virus,ODV)的一种囊膜蛋白ODV-E18为对象,通过E18与一个标记短肽Flag融合的重组病毒的构建,以免疫荧光法跟踪检测E18蛋白的转运过程及形态,并利用酵母双杂交系统法(yeast two hybrid system),通过蛋白-蛋白相互作用的研究,寻找与E18紧密结合的可能的转运蛋白.研究结果表明,E18是先以核内模结构--微泡(microvesicle)的形式存在于核内的;一个被报道具有核定向转运功能的AcMNPV囊膜蛋白-ODV-E66能与E18形成紧密的复合体,推测E-66可能在E18的核定向转运中起着运载体的作用.
-
流行性乙型脑炎病毒囊膜蛋白截片段的克隆及表达
目的 获得流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(JEV)SA14-14-2株囊膜蛋白抗原域Ⅲ基因并在大肠杆菌中表达,为进一步研发JEV血清学检测试剂盒提供抗原.方法 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增JEV SA14-14-2株囊膜蛋白抗原域Ⅲ测序,并定向克隆入原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pET-EⅢ,转化大肠埃氏菌(Escherichia coli,E. coli)BL21菌株,并经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导在大肠杆菌中表达SA14-14-2株囊膜蛋白抗原域Ⅲ.结果 扩增的SA14-14-2株JEV囊膜蛋白截片段基因与发表的SA14-14-2株基因序列完全一致,构建了原核表达载体并在大肠杆菌中得到了表达,且表达产物具有免疫反应性.结论 在大肠杆菌中表达了囊膜蛋白抗原域Ⅲ基因,为进一步研发JEV血清学检测试剂盒提供了抗原.
-
乙型肝炎病毒囊膜蛋白候选结合蛋白的研究进展
HBV囊膜蛋白基因具有多个可变的起始编码位置,囊膜蛋白可能包含前前-S、前-S1、前-S2以及主蛋白等区域,不同长度的囊膜蛋白组分与肝细胞内蛋白的相互作用机制并不清楚.本文着重探讨了现有的蛋白-蛋白相互作用的研究手段,总结了目前宿主肝细胞可能与HBV囊膜蛋白相互作用的蛋白,但目前获得的大部分结果需进一步验证.
-
乙型肝炎病毒前S抗原,PHSAR检测的临床分析
现已明确HBV基因为环状双股DNA,长3.2 Kb,正股不完整,呈半环状,含6个开放读码框架(ORF),其中4个ORF是病毒蛋白的编码区,划分为S区(前S1基因、S2基因和S基因),C区(分前C基因和C基因),P区和X区,分别编码病毒囊膜蛋白(HBsAg),壳体蛋白、复制酶蛋白及X蛋白,其中囊膜蛋白(HBsAg)有前S1蛋白、前S2蛋白、S蛋白,中蛋白和大蛋白等5种成分.
-
一株A和B亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体的制备及其特性
目的:制备A和B亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)特异性单克隆抗体.方法:用ALV-A-SDAU09C1株的env-gp85基因的PCR产物构建重组表达性质粒pET32a-SDAU09C1- gp85,经IPTG诱导后,表达分子量为53 kD的ALV-A囊膜gp85蛋白与GST的融合蛋白,将表达产物免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选杂交瘤细胞株.结果:获得了1株(A6D1株)能与A和B亚群ALV发生反应但不与J亚群ALV反应的杂交瘤细胞株.Western blot试验结果表明,单克隆抗体识别的A和B亚群ALV囊膜糖蛋白的分子量为53 kD.在IFA中,这株单克隆抗体可以与所试验的3株ALV-A和1株ALV-B毒株反应,而与4株ALV-J亚群的毒株不反应.结论:A6D1株单克隆抗体可以用于A和B亚群ALV感染的诊断和流行病学调查,弥补了目前只有J亚群ALV特异性单克隆抗体可用的不足.
-
西尼罗病毒E蛋白在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的表达及其鉴定
目的 利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)囊膜E蛋白,并进行鉴定.方法 利用分子克隆技术将WNV E基因克隆至杆状病毒供体质粒pFastBacl中,构建重组供体质粒pFastBac-E,转化大肠埃希菌DH 10Bac,构建重组穿梭质粒Bac-E,转染sf9细胞,收获含WNV E基因的重组杆状病毒AcMNPV-E,采用间接免疫荧光及Western blot法检测E蛋白的表达.结果 重组供体质粒pFastBac-E经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,重组穿梭质粒Bac-E经PCR鉴定证明构建正确,转染约96 h后,sf9细胞体积变大、变圆,细胞颗粒化,进而从培养板上脱落,漂浮,收获的第1代AcMNPV-E经PCR鉴定为阳性.感染重组杆状病毒AcMNPV-E的sf9细胞周围出现绿色荧光,表达的目的蛋白可与兔抗WNV E蛋白多克隆抗体及鼠抗His单克隆抗体特异性结合,在相对分子质量约53 000处可见目的蛋白条带.结论 利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统成功表达了WNV E蛋白,为WNV快速诊断方法及新型疫苗的建立奠定了基础.
-
HIV-1外膜蛋白与 IFNα在重组鸡痘病毒中的共表达及特性分析
艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的一类疾病,该病已成为危害人类严重的疾病之一,研制AIDS疫苗已成为当务之急.外膜蛋白gp120是由HIV-1囊膜蛋白gp160经蛋白酶裂解而成[1].它不仅与病毒进入细胞有关,同时它含有大量刺激机体产生体液免疫和细胞免疫的抗原决定簇[2-4].因此,它成为人们研制艾滋病疫苗的重要靶蛋白.以病毒为载体构建基因工程活载体疫苗是当前研制疫苗的一个重要途径,它不仅可以诱导体液免疫的产生,同时可引起特异性CTL,尤其对于病毒病的预防更为有效.本研究利用鸡痘病毒中国疫苗株为载体,构建了HIV-1外膜蛋白gp120与IFNα二者共表达的重组鸡痘病毒,探索了利用鸡痘病毒作为AIDS活载体疫苗载体的可行性.
-
绵羊肺腺瘤病毒env基因致瘤机制
绵羊肺腺瘤病是由外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV) 感染引起的肺脏肿瘤性疾病,病毒囊膜基因(env)是引起细胞转化的主要因素.JSRV env 蛋白通过与细胞受体结合激活多种信号转导系统,启动细胞内抑制细胞凋亡和刺激细胞增生从而引起细胞癌变.对env致瘤机制的研究一直是揭示JSRV致病机理研究领域中的热点.本文就对JSRV编码的env基因的致瘤机制及研究进展作综述.
-
加亚嘉西科病毒Env基因导致人支气管上皮细胞的致瘤信号转导机制
人的细支气管-肺泡癌(bronchiolo-alveolar carcinoma,BAC)在WHO分类中,将其作为肺腺癌的一个亚型;近30年国内外报道肺腺癌的发病率明显提高,究其主要原因是细支气管肺泡腺癌的发病率的迅速提高.绵羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是绵羊的一种慢性、进行性、接触性传染的肺脏肿瘤性疾病.由于绵羊肺腺瘤病与人的细支气管-肺泡癌在临床症状、病理组织学特征及超微病变方面极为相似和二者之间所共有的特征,国际上许多研究者把羊肺腺瘤病的病羊作为是一种理想的、唯一的动物模型,来进一步深入地研究人的细支气管肺泡腺癌.羊肺腺瘤病主要是由一种加亚嘉西科逆转录病毒(jaagsiekte retrovirus)引起的.在绵羊体内的加亚嘉西科逆转录病毒的env基因编码的囊膜蛋白能引起人的细支气管肺泡癌.env基因编码的囊膜蛋白,可以与肺泡上皮细胞表面的受体相互作用,引起肺泡上皮细胞的增生癌变.加亚嘉西科逆转录病毒的受体是由HYAL2基因编码的一种糖基化磷脂酰肌醇相关细胞表面蛋白,位于人的第三染色体上,当细胞发生癌变时,HYAL2基因常发生突变.本文作者通过体外细胞转化实验,发现和阐述加亚嘉西科逆转录病毒致瘤的分子机制模式.
-
日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用
根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)SA14-14-2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增编码JEV囊膜蛋白主要抗原域基因,其中含ha基因主要核苷酸序列.将PCR产物定向克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-EHA.阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在.Western-blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性.利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验.结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法.
-
逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验
利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明HCV ele2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,经FACS分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗HCVE1E2蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合.
-
棉铃虫单核衣壳核多角体病毒囊膜蛋白odv-e66基因及其邻近区域的序列分析
杆状病毒ODV-E66蛋白是包涵体来源病毒(occlusion-derived virus,ODV)囊膜的结构蛋白,ODV囊膜对ODV的稳定性和感染性具有重要作用.本文报道了HaSNPV odv-e66基因及其邻近区域共4 237bp的核苷酸序列及其分析结果.HaSNPV的odv-e66基因编码区全长2 019bp,推测编码一个由672个氨基酸残基组成的,分子量为74.5kD的列比较分显示HaSNPV ODV-E66蛋白具有多个保守区域,包括N末端的强疏水功能区、序列中部的一个可能的核定位信号RKIW,两个Leu-zipper以及5个跨膜区.odv-e66基因上游的两个ORF分别与AcMNPV的orf108和orf109具有同源性,下游的ORF与LsNPV的p13基因具有同源性.
-
绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表达可促进NIH3T3细胞增殖
目的 研究外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(exJSRV Env)对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖的影响.方法 构建含完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exISR V-env)的重组质粒pcDN A4/myc-His/ exJSR V-env,并鉴定其正确性.采用脂质体转染技术pcDN A4/myc-His/ exJSR V-env瞬时转染NIH3T3细胞,利用反转录PCR和Western blot法检测Env的表达,利用CCK-8法和平板克隆形成实验检测Env表达对NIH3T3细胞增殖的影响.结果 成功构建了含exJSRV-env的重组真核表达质粒pcDNA4/myc-His/ exJSRV-env;以重组质粒瞬时转染NIH3T3细胞,检测到JSRV Env蛋白的表达,CCK-8法和平板克隆形成实验结果表明转染pcDN A4/myc-His/ exJSR V-env的细胞增殖速度显著高于对照组(空白及阴性)细胞.结论 NIH3T3细胞表达的JSRV Env蛋白可促进NIH3T3细胞的增殖.
