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葡萄球菌肠毒素A真核表达质粒的构建及其在喉癌Hep-2细胞来源exosomes中的表达
目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)与糖基化磷脂酰肌醇(GPI)的真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI并转染人喉癌细胞株Hep-2细胞,检测Hep-2细胞分泌的exosomes中SEA的表达.方法 利用NOT I酶切原核生物质粒pGSI-SEA-GPI粘性末端,琼脂糖凝胶电泳分离、提纯目的基因SEA-GPI,利用T4连接酶连接真核表达质粒pmiR-RB-REPORT与SEA-GPI构建真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI.脂质体法转染pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI至Hep-2细胞,荧光定量实时PCR(qRT-PCR)检测Hep-2细胞SEA-GPI mRNA的表达.提取Hep-2细胞分泌的exosomes,免疫印迹测定SEA在exosomes中的表达.结果 琼脂糖凝胶电泳显示成功构建真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI.qRT-PCR检测显示,pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI转染的Hep-2细胞SEA-GPI mRNA显著表达.免疫印迹显示Hep-2细胞分泌的exosomes中存在SEA蛋白表达.结论 SEA可能通过GPI结构锚定于exosomes膜上,为制备含有SEA-GPI锚定蛋白的SEA-eoxsomes瘤苗提供了依据.
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糖基化磷脂酰肌醇修饰的小鼠IL-21瘤苗抗肿瘤效应及其机制初探
目的 构建糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphafidylinositol,GPI)修饰的小鼠IL-21瘤苗,并对此瘤苗的抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法 通过重叠PCR方法获得IL-21-GPI融合基因并将其插入空载体pcDNA3.1.将鉴定过的重组载体以脂质体法转染B16F10细胞制成瘤苗,细胞间接免疫荧光法及流式细胞仪检测转染瘤细胞膜表面IL-21的表达,通过对小鼠脾细胞的增殖作用鉴定表达的IL-21的生物学活性.将瘤苗接种小鼠后,通过观察小鼠肿瘤体积和生存率分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗免疫鼠的细胞免疫活性.结果 正确构建了pcDNA3.1/IL-21-GPI重组载体,膜表达的IL-21有良好的生物学活性,制备的瘤苗能发挥抗肿瘤效应,其机制与免疫鼠细胞免疫活性增强有关.结论 成功构建了具有抗肿瘤活性的GPI修饰的IL-21瘤苗,为其进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.
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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV的前-X基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个,其中5个是人铁蛋白;1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3);1个是人醛缩酶B;1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAAl);1个是人血红素结合蛋白;1个是人C1酯酶抑制子(C1-INH);1个是人玻连蛋白;1个是人电压依赖性阴离子通道1(VDACl);1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin);1个是人梭素;1个是人纤溶酶原(PLG);3个是人假想蛋白;1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16.结论:成功克隆出前-X的结合蛋白,为进一步研究HBV的前-X蛋白的作用提供了新线索.
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白细胞介素2锚定的exosomes的制备及其对膀胱癌细胞的诱导杀伤效应
目的 制备白细胞介素2(IL-2)锚定的肿瘤细胞来源的exosomes疫苗,探讨其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的抗肿瘤效应.方法 构建含糖基化磷脂酰肌醇(GPI)信号肽序列与人IL-2的融合基因的pEGFP-N1-IL2gpi质粒,建立稳定表达GPI-IL-2的T24细胞系(T24/GPI-IL-2).采用超速和蔗糖梯度密度离心法提取Ex/GPI-IL-2(即T24/GPI-IL-2细胞培养液中提取的exosomes),并对其进行形态学观察和分子标志检测.通过混合淋巴细胞实验和细胞毒实验,观察Ex/GPI-IL-2对T细胞的增殖和诱导杀伤效应.结果 成功构建重组质粒pEGFP-N1-IL2gpi,建立了稳定表达GPI-IL-2蛋白的细胞系.Ex/GPI-IL-2为直径约30~90nm的类圆碟形小囊泡,表达细胞间黏附分子1(ICAM-1)、热休克蛋白70(HSP70)、MAGE-1和GPI-IL-2等免疫相关蛋白.Ex/GPI-IL-2经过树突状细胞负载后,能更有效地诱导T细胞的增殖和细胞毒效应(P<0.05).结论 通过基因转染技术,可以将IL-2锚定到肿瘤细胞来源的exosomes上,获得的Ex/GPI-IL-2能够诱导CTL对肿瘤细胞产生更强的诱导杀伤效应,为以exosomes为基础的肿瘤免疫治疗提供了新的途径.
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肿瘤与血液病患者体内尿激酶受体表达水平临床意义的研究
尿激酶受体(uPAR,CD87)是近年来新发现的一个单链膜糖蛋白.uPAR在体内主要以糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定在血管内皮细胞、平滑肌细胞以及血液粒-单核细胞等的表面.近人们发现肿瘤细胞表面过表达uPAR,从而使其成为国际上研究肿瘤的一个新的热点.本课题中我们制备了抗尿激酶受体(uPAR)的单克隆抗体(单抗),建立了血浆可溶性uPAR(suPAR)以及细胞表面uPAR的检测方法.应用以上方法,比较系统地研究了uPAR的表达与肿瘤(包括白血病)的生物学行为关系以及对PNH诊断的价值,取得了一定的成绩,介绍如下.
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糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D与2型糖尿病
糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)是目前在体内发现的唯一能水解糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的磷脂酶,可调节锚定蛋白的表达和生理功能.近年研究发现胰岛β细胞可合成与分泌GPI-PLD,GPI-PLD不仅具有模拟胰岛素的作用,而且可在体外抑制淀粉样蛋白原纤维的形成,改善糖尿病症状;此外,GPI-PLD分泌受胰岛素分泌的影响,在胰岛素抵抗状态下,GPI-PLD分泌也相应地会在增加后终减少.这些研究结果均提示GPI-PLD与2型糖尿病的发病可能有着密切关联.
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糖基化磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶D与白血病类型、CD24表达及细胞黏附功能的关系
糖基化磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶D(GPI-PLD)在特定的情况下能通过特异性水解糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白中的肌醇磷酸酯键来调节细胞膜上的锚定蛋白表达.在人的造血细胞上有一些GPI锚定蛋白(如CD24、CD87等)属于黏附分子,在肿瘤细胞的转移中发挥重要作用.我们检测了急性白血病患者骨髓细胞GPI-PLD基因表达水平及其活性,探讨其与白血病类型,肝、脾、淋巴结肿大,CD24表达及白血病细胞对纤维连接蛋白(Fn)黏附率的关系.
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GPI信号肽序列与B7-1基因的拼接及其真核表达载体的构建和序列分析
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逆病毒载体介导尿激酶受体基因在乳腺癌细胞表达的研究
大量的临床研究证实尿激酶(uPA)及其受体(uPAR,CD87)表达与肿瘤细胞的侵袭与转移能力相关[1].uPAR是一种由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜的糖蛋白,通过将uPA活性定位于细胞表面(即胞周)而调节蛋白水解过程[1,2].本研究我们利用逆病毒载体将uPAR基因导入低侵袭性乳腺癌细胞MCF-7,为客观评价uPAR基因过表达与乳腺癌细胞侵袭及转移的关系提供了实验模型.
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朊病毒治疗候选药物的研究进展
疯牛病(BSE)、羊瘙痒症(scrapie)、人库鲁病(kuru)和人克雅氏症(CJD)等都是由朊病毒(prion)引起的一类具有高度传染性和致死性的中枢神经系统疾病[1].研究表明,细胞内正常朊病毒(PrPc)是一种广泛地表达于脊椎动物细胞表面的内源性糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白,在体内以单体的形式出现,不具有致病性.朊病毒一旦在某种条件下错误折叠后形成致病性朊病毒( PrPSc),其二级结构发生巨大变化,α螺旋降到30%,而β折叠的含量增至45%.同时,致病性朊病毒能以自身为模板,诱导正常朊病毒向致病性构象转化,进一步在分子间通过“交联β折叠片”聚集,形成淀粉状纤维的有毒片断,终诱导机体内的免疫系统杀死脑神经细胞而导致一系列致死性症状[2-3].
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加亚嘉西科病毒Env基因导致人支气管上皮细胞的致瘤信号转导机制
人的细支气管-肺泡癌(bronchiolo-alveolar carcinoma,BAC)在WHO分类中,将其作为肺腺癌的一个亚型;近30年国内外报道肺腺癌的发病率明显提高,究其主要原因是细支气管肺泡腺癌的发病率的迅速提高.绵羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是绵羊的一种慢性、进行性、接触性传染的肺脏肿瘤性疾病.由于绵羊肺腺瘤病与人的细支气管-肺泡癌在临床症状、病理组织学特征及超微病变方面极为相似和二者之间所共有的特征,国际上许多研究者把羊肺腺瘤病的病羊作为是一种理想的、唯一的动物模型,来进一步深入地研究人的细支气管肺泡腺癌.羊肺腺瘤病主要是由一种加亚嘉西科逆转录病毒(jaagsiekte retrovirus)引起的.在绵羊体内的加亚嘉西科逆转录病毒的env基因编码的囊膜蛋白能引起人的细支气管肺泡癌.env基因编码的囊膜蛋白,可以与肺泡上皮细胞表面的受体相互作用,引起肺泡上皮细胞的增生癌变.加亚嘉西科逆转录病毒的受体是由HYAL2基因编码的一种糖基化磷脂酰肌醇相关细胞表面蛋白,位于人的第三染色体上,当细胞发生癌变时,HYAL2基因常发生突变.本文作者通过体外细胞转化实验,发现和阐述加亚嘉西科逆转录病毒致瘤的分子机制模式.
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糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的研究进展
羧基端结合有糖基化磷脂酰肌醇(GPI)结构的膜蛋白,称为GPI锚定蛋白;此后不久又鉴定出一种GPI锚定蛋白专一性的磷脂酶D(GPI-PLD).GPI-PLD能特异性地水解GPI、释放出锚定蛋白并调节锚定蛋白的表达和生物功能等.本文概述了近年来有关GPI-PLD的研究状况,包括它的组织和器官来源、生理功能、病理条件下的活性改变、分子结构以及cDNA克隆等.
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糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因表达与临床相关疾病
羧基端结合有糖基化磷脂酰肌醇(GPI)结构的膜蛋白称为GPI锚定蛋白,具有广泛功能.糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)是人体内唯一能特异性水解GPI并能释放出锚定蛋白的磷脂酶,可调节锚定蛋白的表达和生理功能.GPI-PLD可能成为评估预后的标记物.在某些肝脏疾病、恶性肿瘤、糖尿病等疾病中有GPI-PLD基因异常表达.
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鼻咽癌患者糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D 活性及其表达水平的初步研究
目的 ①通过研究正常人和鼻咽癌患者的糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD) 的酶活性和酶促反应的3-D 图,探索鼻咽癌患者该酶活性的变化情况及该酶促反应的可能机制.②通过研究正常人和鼻咽癌患者GPI-PLD mRNA 的表达水平,探寻鼻咽癌患者该酶活性变化的可能机制,为鼻咽癌的诊断、预后估计提供有效指标.方法 ①采用我室自制的具完整GPI 结构的胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)作底物进行酶促反应,测定正常人和鼻咽癌患者GPI-PLD 的酶活性并应用韩国新科有限公司生产的Photodiode Array Uv-Vis Spectrophotometer 仪器研究了该酶的催化机理,并且利用该机所带软件作出3-D 图.②采用逆转录PCR (RT-PCR)检测正常人和鼻咽癌患者的GPI-PLD mRNA 的表达水平,以RT-PCR 结果的琼脂糖电泳照片的积分光密度值(IA)比值代表GPI-PLD mRNA 的表达水平.结果 ①正常人和鼻咽癌患者血清GPI-PLD的活性水平(均以转化底物百分比表示)分别为17.6%±2.7% 和20.6%±2.4%,鼻咽癌患者的血清GPI-PLD 活性比正常人血清GPI-PLD 活性显著增高(P<0.05).并且其酶促反应的3-D 图显示有直观差异.2.RT-PCR检测GPI-PLD mRNA 的表达,结果表明正常人鼻咽上皮细胞中GPI-PLD mRNA 琼脂糖电泳照片的平均积分光密度比值(IA 比值)是2.6131±0.7653,鼻咽癌患者鼻咽上皮细胞中GPI-PLD mRNA 琼脂糖电泳照片的平均积分光密度比值(IA 比值)是9.3522±5.2879,鼻咽癌患者的GPI-PLD mRNA 的表达水平比正常人鼻咽上皮细胞中GPI-PLD mRNA 的表达水平显著性增高(P<0.05).结论 ①鼻咽癌患者的血清GPI-PLD 活性比正常人显著增高,其酶促反应的3-D 图也与正常人有明显差异,提示测定GPI-PLD 活性可作为临床诊断鼻咽癌的生化指标.②鼻咽癌患者GPI-PLD mRNA 的表达水平高于正常人.GPI-PLD mRNA 表达增强是导致鼻咽癌患者GPI-PLD 酶活性增高的主要机制.
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GPI-PLD基因表达在K562细胞对补体杀伤的敏感性中的影响
目的:观察葡萄糖、胰岛素诱导K562细胞GPI-PLD基因表达对GPI锚定CD55,CD59的影响,以及对补体依赖的细胞毒(complement dependent cytotoxicity,CDC)杀伤K562细胞的影响.方法:采用免疫印迹检测CD55和CD59表达,定量测定GPI-PLD酶活性,台盼蓝排斥法观察CDC杀伤率.结果:诱导24 h及48 h,胰岛素组、葡萄糖+胰岛素组酶活性、杀伤率明显增高.24 h时对照组、葡萄糖组、胰岛素组膜蛋白检出CD55,对照组、葡萄糖组膜蛋白及胰岛素组、葡萄糖+胰岛素组培养基中检出CD59.48 h时对照组膜蛋白,葡萄糖组、胰岛素组、葡萄糖+胰岛素组培养基检出CD55,CD59.结论:胰岛素诱导使K562细胞的GPI-PLD酶活性明显升高,导致GPI锚定CD55和CD59释放进入培养基,K562细胞对补体杀伤的敏感性增强.
关键词: 糖基化磷脂酰肌醇 糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D CD55 CD59 免疫印迹 -
阵发性睡眠性血红蛋白尿症发病机制的研究进展
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种由体细胞突变引起异常造血干细胞克隆性增殖的疾病,患者具有慢性血管内溶血、血细胞减少和血栓形成等临床表现.其病理缺陷主要是磷脂酰肌醇聚糖-A(PIG-A)基因突变,导致PNH病理细胞表面缺乏所有需以糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白.但仅有PIG-A基因突变并不发生PNH.只有在其它因素影响下导致正常骨髓造血衰竭时,使异常的PNH克隆大量增殖,部分地取代正常造血,才会引起发病.因此,PNH发病机制的阐明对提高该病的诊断与治疗水平有重要意义.
关键词: 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 Pig-a基因 糖基化磷脂酰肌醇 锚定蛋白 -
稳定表达GPI-CD80融合蛋白CHO细胞株的构建
目的 将糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定型人CD80重组基因的真核细胞表达质粒pRM10/GPI-CD80转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),构建CHO/GPI-CD80稳定表达细胞株.方法 将pRM10/GPI-CD80用脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选出阳性细胞克隆.采用流式细胞术和免疫荧光染色检测CHO/GPI-CD80稳定表达细胞株表达GPI-CD80蛋白的效率的变化.结果 转染GPI-CD80基因的CHO细胞在G418筛选下出现阳性克隆,且经过传代后不同代数的克隆细胞表面表达GPI-CD80的阳性率差异无统计学意义.结论 pRM10/GPI-CD80在CHO细胞中成功表达,表达稳定且效率较高.
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人类精子糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白研究进展
在大多数真核生物中,糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚作为一种翻译后修饰定位蛋白质的C端而定位于细胞膜的外叶.GPI锚的结构上主要由三部分组成:磷酸乙醇胺连接部分、聚糖部分和磷脂尾部分.因GPI锚定蛋白结构和功能的多样性而在众多生物学过程中起到重要作用[1].在人精子膜同样存在GPI锚定蛋白,这些蛋白在精子成熟、精子储存、精子免疫防御、精卵识别和精卵融合等多方面具有重要意义.本文概述了近来人类精子GPI锚定蛋白研究进展和GPI锚定蛋白批量化在线预测软件,以期为男性节育、避孕以及生殖药物研发提供新的靶点和思路.
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重组人vWF A3-GPI融合蛋白在CHO细胞膜上的表达及其生物学活性
目的 在CHO中表达人vWF A3-GPI融合蛋白并测定其生物学活性,以期获得能够锚定至细胞表面,并引导其黏附于受损血管壁的分子.方法 构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-vWF A3-GPI,转染CHO细胞.采用流式细胞术和免疫荧光激光共聚焦显微镜观察其对细胞膜的锚定作用.应用CCK8法测定其结合胶原的能力及经不同浓度PI-PLC处理后的变化情况.结果 vWF A3-GPI融合蛋白能够锚定在CHO细胞膜上,并具有很好的胶原结合活性;PI-PIC处理后,其胶原结合活性降低,降低程度与PI-PLC浓度成正比.结论 CHO中高效表达的人vWF A3-GPI融合蛋白具有良好的生物学功能,能有效地锚定至细胞表面,并保持良好的胶原结合效应,可作为引导细胞黏附于受损血管壁的分子.
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SEA基因与GPI信号肽序列融合基因的真核表达载体的构建和序列分析
目的将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcus enterotoxin A,SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列,即糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol,GPI)附着信号序列,拼接成融合基因,并构建该融合基因的真核表达载体.方法利用基因SOEing法,分别扩增hPLAP-1 C末端信号肽序列和SEA基因,然后将二段基因拼接起来,拼接后与pGEM-T克隆载体连接,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,测序鉴定.结果分别成功扩增出hPLAP-1 C末端信号肽序列131 bp和SEA基因789 bp,并将二段基因序列成功拼接(901 bp),且成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/SEA-GPI,经测序是正确的.结论真核表达载体pcDNA3.1(+)/SEA -GPI的构建,为研究SEA -GPI抗肿瘤作用奠定了基础.
关键词: 超抗原 金黄色葡萄球菌肠毒素A 人胎盘碱性磷酸酶 糖基化磷脂酰肌醇