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禽白血病病毒p27基因在原核细胞的表达及生物学特性的初步分析
将禽白血病病毒(ALV)的p27基因克隆入表达性载体pET28a,在大肠杆菌以His Tag融合蛋白的形式获得了高效表达.以表达产物免疫家兔,制备了抗ALV p27的多克隆抗体,经亲和纯化后,用此抗体建立了对ALV抗原的双抗体夹心法ELISA,并对疑似病料进行了实验室诊断.检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到98.6%,证明表达产物保留了天然p27蛋白的相关抗原性.交叉试验和群特异性试验证明,此方法具有良好的特异性,并且可以检测出A、B、J亚群的禽白血病病毒p27抗原.用此ALV抗体和所建立的ELISA方法成功地进行了禽白血病病毒抗原的实验室诊断.
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建立快速检测禽白血病病毒的液相芯片方法
目的 建立快速检测禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)的液相芯片方法,为大量样品的检测提供技术支撑.方法 制备抗ALV P27单克隆抗体,生物素标记抗体,磁珠偶联捕获抗体,利用Luminex200分析系统验证该方法的特异性、敏感性及重复性.结果 阳性判定标准定为大于或等于空白对照的两倍.特异性检测结果显示与鸡的其他多种病原不存在交叉反应,特异性良好.同时多批次实验结果显示其变异系数在7％以内,说明该方法的稳定性好,可重复.结论 建立的检测ALV病原的液相芯片方法特异性好,稳定且可重复.
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实时荧光定量PCR技术在SPF鸡四种垂直传播疾病监测中的应用
目的 探讨荧光定量PCR检测技术对SPF鸡四种垂直传播病毒的检测应用.方法 采集60份SPF鸡及70份普通鸡群蛋清、泄殖腔试子样品,提取样品核酸,分别进行ARV、REV、CAV、ALV四种病毒实时荧光定量PCR检测,根据标准曲线及溶解曲线分析判读样品病毒拷贝数.结果 SPF鸡ALV 2份阳性,检出率3.3％,其余病毒检测均为阴性；普通鸡样品REV检测2份阳性,检出率2.9％,ALV 10份阳性,检出率14.3％.结论 荧光定量PCR检测方法低可检测到100个拷贝核酸,检测灵敏度较高,有望应用于SPF鸡临床样品的病原检测.
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一株A和B亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体的制备及其特性
目的:制备A和B亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)特异性单克隆抗体.方法:用ALV-A-SDAU09C1株的env-gp85基因的PCR产物构建重组表达性质粒pET32a-SDAU09C1- gp85,经IPTG诱导后,表达分子量为53 kD的ALV-A囊膜gp85蛋白与GST的融合蛋白,将表达产物免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选杂交瘤细胞株.结果:获得了1株(A6D1株)能与A和B亚群ALV发生反应但不与J亚群ALV反应的杂交瘤细胞株.Western blot试验结果表明,单克隆抗体识别的A和B亚群ALV囊膜糖蛋白的分子量为53 kD.在IFA中,这株单克隆抗体可以与所试验的3株ALV-A和1株ALV-B毒株反应,而与4株ALV-J亚群的毒株不反应.结论:A6D1株单克隆抗体可以用于A和B亚群ALV感染的诊断和流行病学调查,弥补了目前只有J亚群ALV特异性单克隆抗体可用的不足.
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禽白血病病毒J亚群env基因的克隆和序列分析
应用多聚酶链反应（PCR）的方法扩增出ADOL-4817毒株的囊膜 蛋白env基因，并克隆进大肠杆菌。经核酸序列分析证明，env基因的大小为1?746 ?bp，其中gp85 和gp37由1?554?bp组成，可翻译成517个氨基酸，分子量为57.7?kD。根 据糖基化位点N-X-S/T的特点，发现ADOL-4817的env蛋白有15个潜在的糖基化位点。 同源性分析证明，ADOL-4817的env基因与其它ALV-J的env基因序列同源性为88.8 %～92.4%，而与外源性ALVs 的相应序列的同源性仅为40.5%～51.4%，然而，与内源性的EAV -HP毒株的类env 基因的同源性高达91.2%； 另外，ADOL-4817毒株的gp37 在C末端 多了13个氨基酸。这些结果提示，ALV-J的env基因存在广泛的变异性， env基因 可能来源于内源性和外源性ALVs 的重组。
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禽白血病病毒p19基因末端片段在大肠杆菌中的表达
根据禽白血病病毒（ALV）p19基因末端序列合成一条82?bp的双链DNA片段，将其克隆到表达质粒pGEMEX-1中，序列分析结果与设计的相符。重组表达质粒转化的 大肠杆菌BL21（DE3）经 IPTG诱导后产生34kD融合表达产物，与理论值相符；Western-blo t分析表明该表达产物能与兔抗ALV血清发生反应。
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A亚群禽白血病病毒囊膜基因gp85片段在大肠杆菌中的表达
将RAV-1 囊膜基因gp85片段亚克隆到表达质粒pET-21d(+)中得到重组表达质粒pET-21d-RAV-1 env(BglII /SalI),序列分析表明该插入片段的核苷酸序列和阅读框都与RAV-1囊膜基因相应序列相同.用其转化大肠杆菌BL21(DE3)并经 IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明RAV-1囊膜基因融合蛋白表达产物约20kD,与理论值相符;IPTG诱导起始时间比诱导持续时间对表达量的影响更大.
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NOV基因研究进展
1992年Joliot在肾母细胞瘤725中发现了高水平表达的约20 000 bp RNA,随后分离得到其cDNA,以这种cDNA为探针研究发现这种基因高度表达于所有的禽白血病病毒诱导的肾母细胞瘤中,遂将其命名为肾母细胞瘤过度表达fnephroblastoma overexpressed,NOV)基因[1].
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安徽进口鸡群禽白血病感染状况的调查
[目的]了解禽白血病病毒在安徽辖区进口鸡群中的感染情况。[方法]随机采集1日龄胎粪、不同日龄段泄殖腔棉拭子检测禽白血病病毒群特异性p27抗原、采集血清检测ALV-AB及J亚型抗体，收集种蛋检测蛋清p27抗原。[结果]祖代蛋鸡1日龄胎粪和200日龄泄殖腔棉拭子p27抗原的阳性率分别为18.2%、45%、4.5%、15%；种蛋蛋清p27抗原全为阴性，父母代蛋鸡180日龄泄殖腔棉拭子和种蛋清p27抗原的阳性率分别为21.9%、10%；祖代和父母代蛋鸡ALV-J抗体全为阴性，ALV-AB抗体阳性率分别为9%、10%、28.1%。祖代肉鸡泄殖腔棉拭子p27抗原阳性率分别为5%、6.7%、3.3%，种蛋蛋清p27抗原全为阴性；哈伯德鸡群ALV-J抗体为阴性，AA鸡群ALV-J抗体阳性率为20%；两个品种不同日龄肉鸡ALV-AB抗体的阳性率分别为32.5%、63.3%、80%。[结论]安徽进口鸡群中ALV-J仅AA鸡群有20%的感染率，ALV-AB的感染率分别为9%、10%、28.1%、32.5%、63.3%、80%。
