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E-cadherin、Cyclin D1和Cyclin E在叶绿酸抗细胞恶变中表达研究
目的 研究叶绿酸干预反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(反式-BPDE)恶性转化人支气管上皮细胞系16HBE中的细胞周期相关基因及蛋白的影响.方法 应用半定量RT-PCR技术检测叶绿酸干预反式-BPDE恶性转化细胞中各组细胞E-cadherin基因mRNA表达差异;荧光细胞免疫化学技术检测E-cadherin、Cyclin D1及Cyclin E蛋白水平.结果 反式-BPDE诱导恶变细胞组出现E-cadherin基因在mRNA和蛋白水平表达缺失,而经叶绿酸抗转化组该基因表达正常.Cyclin D1、Cyclin E蛋白在正常对照组中表达阴性,而在反式-BPDE恶性转化组中上述两种蛋白呈现高表达,通过叶绿酸干预抗转化组中其表达明显下调.结论 叶绿酸抗反式-BPDE致细胞恶变作用与其避免抑癌基因E-cadherin的表达缺失有关.叶绿酸在拮抗反式-BPDE致癌中具有影响细胞周期素CyclinD1和CyclinE表达作用.
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抑制性消减杂交技术检测反式二羟环氧苯并芘转化细胞与正常细胞基因表达差异
目的 筛选7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(BPDE)转化细胞与正常细胞的基因表达差异.方法以BPDE转化支气管上皮细胞(16HBE)细胞为检测子(tester),正常16HBE细胞为驱动子(driver),应用抑制性消减杂交方法构建cDNA消减文库,经2次消减杂交和2次PCR后,将巢式PCR产物插入TA载体克隆,随机挑选克隆进行鉴定和测序,并用斑点杂交法验证其同源性,将所得序列进行GenBank的BLAST分析.结果发现了7个在BPDE转化细胞中高表达的基因,为翻译延长因子1α1、线粒体基因、溶解物载体家族25、EphA2、酪氨酸-3-加单氧酶/色氨酸-5-加单氧酶活化蛋白、乳酸脱氢酶A、TRIM28等,尚有一条在GenBank的已知基因中找不到对应序列,在EST序列中找到全长对应序列.结论发现的高表达基因可能在BPDE的致癌机制中起作用,另外,可能有未知基因与BPDE的恶性转化作用有关.
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miR-542-3p在反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导致癌中的作用
目的 探讨反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导恶变的人支气管上皮细胞(16HBE-T)中miR-542-3p在细胞恶性转化中的作用.方法 运用实时荧光定量PCR法验证miR-542-3p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)中的表达水平.瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平,检测miR-542-3p表达水平改变对16HBE-T细胞的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、软琼脂克隆形成率及细胞迁移能力的影响.结果 转染前16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是16HBE-N的(39.08±6.95)%(t=15.18,P＜0.05).瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平后,16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是转染前的(5.23±0.55)倍(t=17.37,P＜0.05).miR-542-3p模拟物组(mimic组)与16HBE-T组(100%)相比,增殖率下降到(62.06±5.61)%(t=-17.28,P＜0.05),G0/G1期比例上升到(74.76±4.86)%(t=4.53,P＜0.05),克隆形成率降低为(5.87±0.67)%(t=-6.66,P＜0.05).mimic组生长细胞覆盖区面积比(0.31±0.08)明显降低(t=-6.78,P＜0.05),凋亡无改变.结论 miR-542-3p表达水平升高会降低anti-BPDE恶性转化细胞的增殖能力和恶性程度,推断miR-542-3p是类抑癌基因,在anti-BPDE诱导致癌过程中低表达的miR-542-3p可能是促成恶性转化的重要因素.
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BPDE诱导GC-1细胞凋亡及褪黑素的保护作用
目的 探讨7,8-二羟-9,10-环氧苯并[a]芘(benzo[a]pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide,BPDE)对小鼠精原细胞株GC-1的细胞毒性机制及褪黑素的保护作用.方法 不同浓度BPDE处理GC-1细胞,采用Annexin V/PI染色及流式细胞仪检测细胞凋亡,JC-1探针染色检测线粒体膜电位,Western blot检测细胞质Cyt C及细胞总蛋白中caspase-9/3的活化水平,DCFH-DA探针及流式细胞仪检测细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平.褪黑素预处理细胞后再进行BPDE染毒,采用上述方法检测褪黑素对BPDE细胞毒性的影响.结果 BPDE可提高GC-1细胞凋亡率,存在剂量-效应关系.同时,BPDE可降低细胞线粒体膜电位,促进线粒体Cyt C的释放,提高细胞中caspase-9和caspase-3蛋白的活化水平,并诱导细胞中ROS水平升高.褪黑素预处理则可降低BPDE诱导的细胞凋亡,抑制Cyt C的释放及caspase-9/3的活化,并激活Nrf-2/ARE抗氧化通路,降低细胞ROS水平.结论 BPDE可诱导小鼠精原细胞GC-1线粒体途径细胞凋亡和氧化应激,而褪黑素在这一过程中起保护作用.
