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硫酸镍对体外培养小鼠精原细胞的损伤作用
目的 初步探讨硫酸镍(NiSO4)对小鼠精原细胞的毒作用.方法 采用MTT、分光光度法和透射电子显微镜分别检测NiSO4,浓度为0、25、50、100、200、400和800μmol/L,染毒6、12、24和36 h对体外培养小鼠精原细胞的增殖、乳酸脱氢酶(LDH)活力及其超微结构的影响.结果 NiSO4显著抑制体外培养小鼠精原细胞的增殖,且存在剂量/时间依赖性(r=1,P＜0.01).50 μmol/L NiSO4染毒24和36 h,100、200、400和800 μmol/L NiSO4染毒6、12、24和36 h时,精原细胞悬液LDH活力显著低于对照组(P＜0.05),并呈剂量/时间依赖性(r=-1,P＜0.01).此外,NiSO4还可引起小鼠精原细胞超微结构改变,主要表现为细胞皱缩、胞内出现空泡,细胞膜和核膜破裂,细胞器模糊不清等现象,特别是NiSO4浓度在200μmol/L以上变化更明显.结论 NiSO4对体外培养的小鼠精原细胞具有明显毒作用.
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硫酸镍处理原代培养大鼠睾丸间质细胞某些生化指标的变化
目的 从氧化应激角度,探讨硫酸镍对体外培养大鼠睾丸间质细胞损伤的机制.方法 选择健康雄性Wistar大鼠,采用胶原酶消化以及Percoll分离液密度梯度离心法,经体外贴壁培养获得高纯度大鼠睾丸间质细胞.取对数生长期大鼠睾丸间质细胞,硫酸镍0、250、500和1 000μmol/L分别处理6、12和24 h后收集细胞,超声处理后离心取上清液,采用分光光度法检测过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活力,羟自由基(·0H)抑制能力以及丙二醛(MDA)含量.结果 硫酸镍各浓度组与对照组比较:硫酸镍染毒6h时,硫酸镍l 000 μmol/L组CAT活力显著降低(P＜0.01),硫酸镍500 μmol/L抑制羟基由基能力也开始降低(P＜0.01);染毒12h时,硫酸镍500 μmol/L组CAT活力开始下降(P＜0.01),各染毒组SOD活力和抑制羟基由基能力开始降低(P＜0.01);染毒24 h时,各染毒组CAT和SOD活力以及抑制羟自由基能力均降低,MDA含量升高(P＜0.05或P＜0.01).结论 硫酸镍可致大鼠睾丸间质细胞抗氧化能力下降而致氧化损伤.
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硫酸镍对细胞膜脆性及甘油通透性的影响
生物膜是镍细胞毒性作用的靶位之一.镍与细胞膜的相互作用可以抑制细胞膜(包括红细胞膜、心肌细胞膜)上的Na-K-ATP酶和Ca-ATP酶的生物活性[1].但镍对细胞膜脆性及其对有机分子跨膜转运的影响尚未见文献报道.本研究以大鼠红细胞、猪红细胞为生物材料,观察了硫酸镍对红细胞膜脆性及甘油通透性的影响.以期为阐明镍的膜毒性作用及机制提供实验依据.
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硫酸镍诱导大鼠睾丸细胞凋亡的研究
镍(Ni)既是人体的必需微量元素,参与人体的许多正常代谢过程,又是常见的环境污染物之一.属于一种多器官、多系统毒物,并且对生殖系统具有一定的损伤,但其详细机制不清[1].本研究拟通过雄性动物整体染毒硫酸镍(NiSO4),探讨Ni对男性生殖系统睾丸的损伤及其机制,为Ni毒性的防治提供实验室理论依据.
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硫酸镍诱导小鼠卵巢细胞P53、P16、Bcl-2蛋白表达的研究
以前研究中我们得知,腹腔注射硫酸镍(NiSO4)致雌性小鼠卵巢损伤作用与NiSO4调控细胞周期诱导细胞凋亡有关[1].本研究用免疫组化法测定NiSO4.
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中药防治硫酸镍致肝肾损伤的实验研究
文献报道,硫酸镍直接损伤肝肾组织,并使天冬氨酸转氨酶(AST),丙氨酸转氨酶(ALT)等酶活力增加[1～5].本实验观察了扶正解毒汤(FJD)对硫酸镍致肝肾损伤的防治作用,现报告如下.
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硫酸镍对原代培养大鼠睾丸间质细胞DNA氧化损伤的研究
目的 探讨硫酸镍(NiSO4)致原代培养大鼠睾丸间质细胞DNA氧化损伤的作用.方法 选择健康成年雄性Wistar大鼠,采用胶原酶消化以及Percoll分离液梯度密度离心法,经贴壁培养获得高纯度大鼠睾丸间质细胞,采用3β-HSD法鉴定细胞纯度.取对数生长期的间质细胞,分别用浓度为0、250、500和1000μmol/L硫酸镍处理6、12和24 h.采用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平;分光光度法检测间质细胞抑制羟自由基能力(Anti-OH·),酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞内8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量.结果 经3β-HSD法鉴定,睾丸间质细胞纯度达95％以上.与对照组比较,250 μmol/L硫酸镍处理12h组和500、1000μmol/L硫酸镍各处理组,ROS水平均增高(P＜0.05);250μmol/L硫酸镍处理12和24 h组,以及500、1000 μmol/L硫酸镍各处理组,Anti-OH·均降低(P ＜0.05);500、1000μmol/L硫酸镍处理12和24 h组,8-OHdG含量均增加(P＜0.05).结论 硫酸镍致大鼠睾丸间质细胞DNA氧化损伤可能与其导致间质细胞Anti-OH·降低和ROS水平增加有关.
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硫酸镍对体外培养大鼠睾丸间质细胞毒作用的实验研究
目的 建立大鼠睾丸间质细胞体外分离、纯化和培养的方法,探讨不同浓度和时间硫酸镍对大鼠睾丸间质细胞的毒作用.方法 采用胶原酶消化、Percoll分离液密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、纯化睾丸间质细胞,并采用3β-HSD染色法进行纯度鉴定.硫酸镍(NiSO4)0、62.5、125、250、500和1 000 μmol/L对分离纯化的睾丸间质细胞染毒,采用MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)渗漏法观察染毒3、6、12、24、36和48 h后,睾丸间质细胞增殖和培养上清液中LDH活力的变化.结果 (1)纯化的睾丸间质细胞经3β-HSD特异性染色鉴定,纯度可达到95％以上.(2)相同时间NiSO4各浓度组与对照组比较:染毒12 h后,NiSO4各浓度组均出现间质细胞增殖抑制(P＜0.01)；染毒6h后,NiSO4各浓度组培养液中LDH活力均开始升高（P＜0.05或P＜0.01）.(3)相同浓度各染毒时间与对照组(0 h)比较:NiSO4 250μmol/L及其以上浓度组,各染毒时间均可抑制间质细胞增殖(P＜0.01).除NiSO462.5 μmol/L染毒3h组外,其他各浓度不同染毒时间LDH活力均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）.结论 建立了较理想的体外分离、纯化和培养睾丸间质细胞的方法；镍对体外培养的睾丸间质细胞具有明显的毒作用,并呈现一定的剂量—效应和时间—效应关系.
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扶正解毒汤防治镍对心肌线粒体酶活性的影响
硫酸镍对心脏的毒作用与接镍人群的接镍时间和接镍剂量成正相关，镍对小鼠心电图影响亦有报道。但对镍引起心脏毒性的中医药防治未见报道，本课题采用扶正解毒汤防治镍引起的心脏毒性，并对其防治机制作了初步的探讨。
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硫酸镍对大鼠生殖细胞的影响
镍(Ni)是人体必需的微量元素,也是环境污染物之一,过量的Ni摄入可造成机体多系统,多器官损伤.研究发现,Ni可透过血睾屏障,对雄性动物的生殖功能造成不良影响[1].
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硫酸镍诱导体外大鼠睾丸间质细胞凋亡及其对c-kit和caspase-3基因表达的影响
目的 观察硫酸镍( NiSO4)诱导体外培养大鼠睾丸间质细胞凋亡及其c-kit和caspase-3 mRNA及蛋白表达的变化,探讨镍致睾丸间质细胞损伤的可能机制.方法 体外提取和纯化大鼠睾丸间质细胞,用0、250、500和1 000μmol/L NiSO4分别处理睾丸间质细胞,染毒时间分别为6、12和24 h.采用AnnexinV-FITC/PI流式细胞术检测睾丸间质细胞的凋亡发生率,实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测c-kit和caspase-3 mRNA及蛋白的表达水平.结果 (1) AnnexinV-FITC/PI流式细胞术检测结果显示,间质细胞凋亡主要发生于NiSO41000 μmol/L染毒12 h和NiSO4 250、500、l 000 μmol/L染毒24 h组.(2)实时荧光定量PCR结果显示:与对照组比较,染毒6 h NiSO4 250 μmol/L、染毒12hNiSO4 250和500 μmol/L c-kit mRNA相对表达量上调(P＜0.05)；染毒24 h NiSO4 500和l 000 μmol/L c-kit mRNA相对表达量下降(P＜0.05).NiSO4各浓度和各时间组caspase-3 mRNA相对表达量均上调(P＜0.05).(3)Western blotting结果显示:与对照组比较,NiSO4各浓度c-kit蛋白表达逐渐减弱,caspase-3蛋白表达逐渐上调,主要见于NiSO41 000 μmol/L染毒6h以及NiSO4各浓度分别染毒12和24 h.结论 NiSO4可诱导体外大鼠睾丸间质细胞凋亡,且与基因c-kit和caspase-3 mRNA及蛋白异常表达有关.
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扶正解毒颗粒对镍诱导大鼠睾丸生精细胞凋亡的拮抗作用
目的 探讨扶正解毒颗粒(FJK)对镍诱导大鼠睾丸生精细胞凋亡的拮抗作用.方法 选择健康成年Wistar雄性大鼠,NiSO4 2.5 mg/kg腹腔注射染毒,FJK 2.5、5.0和10.0 g/kg灌胃处理.30 d后,处死大鼠摘取睾丸,采用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测生精细胞凋亡,免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白的表达水平.结果 NiSO4染毒后,生精细胞总凋亡率升高(P＜0.05),以生精周期Ⅰ～Ⅺ期、Ⅻ～ⅩⅢ期和ⅩⅣ期的精原细胞和精母细胞为主(P＜0.05);精原细胞Bcl-2蛋白表达阳性细胞数减少,主要见于Ⅰ～Ⅵ期、Ⅻ～ⅩⅢ期和ⅩⅣ期(P＜0.05),精母细胞为Ⅰ～Ⅵ期、Ⅻ～ⅩⅢ期多见(P＜0.05);Bax蛋白表达阳性细胞数增多,精原、精母细胞均以Ⅰ～Ⅵ期、Ⅻ～ⅩⅢ期为主(P＜0.05).FJK处理后,上述异常变化有所改善,以10.0和5.0g/kg为主(P＜0.05).结论 FJK对NiSO4所致大鼠睾九生精细胞凋亡具有拮抗作用,其机制可能与其引起Bcl-2表达上调和Bax表达下调有关.
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硫酸镍对体外小鼠精原细胞所致氧化应激水平的研究
目的 探讨硫酸镍对体外培养小鼠精原细胞的氧化损伤作用.方法 进行小鼠精原细胞的体外分离、纯化和培养,设置对照组和硫酸镍(NiSO_4)50、100、200、400、800 μmol/L 5个测定组,等容积染毒后分别培养6、12、24和36h;在各染毒终点收割细胞,超声处理细胞悬液,离心取上清液,采用酶标仪检测总抗氧化能力(T-AOC)、羟自由基(-OH˙)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的变化.结果 镍可引起精原细胞-OH˙含量升高,T-AOC、GSH-Px活性降低.相同染毒时间,NiSO_4各浓度组与对照组比较:染毒36 h后NiSO_450 μmol/L组开始出现-OH˙含量升高及T-AOC水平的下降;染毒各时间段,NiSO_4200、400和800μmol/L组T-AOC、-OH˙含量及其GSH-Px活力与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05).相同浓度各染毒时间组与0 h比较:NiSO_450 μmol/L染毒36 h,开始出现T-AOC、-OH˙含量的异常变化(P<0.05);NiSO_4100μmol/L组染毒24 h及其以上均出现GSH-Px、-OH˙和T-AOC的改变(P<0.05);NiSO_4200 μmol/L及其以上组,各时间组T-AOC、-OH˙、GSH-Px与0 h比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在本试验条件下,镍对小鼠精原细胞的损伤可能与其所致氧化应激效应增强有关.
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扶正解毒颗粒对硫酸镍致大鼠睾丸生殖细胞损伤的拮抗作用
目的 探讨扶正解毒颗粒(FJK)对镍致大鼠睾丸生殖细胞毒作用的拮抗作用.方法 选择健康成年Wistar雄性大鼠,硫酸镍(NiSO4)2.5 mg/kg腹腔注射染毒,FJK 2.5、5.0和10.0灌胃处理.采用流式细胞术检测各组大鼠睾丸组织中各倍体细胞所占的比率及其细胞周期的变化;透射电子显微镜观察睾丸细胞的形态学变化.结果 NiSO4可使睾丸组织G0/G1期细胞数减少,G2/M期细胞数增加(P＜0.05);各倍体细胞比率的分析发现,1C:2C、4C:2C和4C:S比值升高(P＜0.05);用FJK处理后,FJK 5.0、10.0 g/kg组睾丸G0/G1期细胞数回升,G2/M期细胞数减少,各倍体细胞比率趋于正常,与NiSO4组比较差异有统计学意义(P＜0.05).电子显微镜观察显示,NiSO4可引起大鼠生殖细胞核固缩、核质间隙增宽,核膜皱缩、染色质聚集、胞浆可见空泡、线粒体肿胀等不同程度的形态学改变;用FJK处理后,FJK 5.0、10.0 g/kg组上述表现明显改善,尤其FJK 10.0 g/kg组超微结构基本恢复正常.结论 FJK对NiSO4所致大鼠睾丸各倍体细胞比率、细胞周期和超微结构的异常改变均具有逆转作用.
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镍染毒大鼠睾丸生精细胞凋亡及其对Bcl-2和Bax表达的影响
目的 探讨硫酸镍诱导大鼠睾丸生精细胞凋亡的类型及其对生精细胞Bcl-2、Bax蛋白表达和雌二醇水平的影响.方法 健康性成熟Wistar雄性大鼠32只,随机分为4组,正常对照组,硫酸镍1.25、2.5、5.0 mg/kg 3个剂量组.腹腔注射染毒,1次/d,连续30 d.采用原位缺口末端标记法(TUNEL)检测睾丸生精细胞凋亡;免疫组化SABC法检测生精细胞Bcl-2和Bax蛋白表达;放射免疫法检测血清雌二醇(E2)水平.结果 与对照组比较,各剂量组大鼠睾丸生精细胞凋亡增多(P＜0.05),且凋亡细胞主要是生精早期和晚期阶段的精原细胞和精母细胞.各剂量组大鼠生精细胞Bcl-2阳性表达减少而Bax阳性表达增多,且血清E2水平降低(P＜0.05).结论 硫酸镍可诱导大鼠睾丸精原细胞和精母细胞凋亡,其机制可能与生精细胞内Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调以及雌二醇水平降低有关.
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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5～8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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气管滴注硫酸镍对大鼠炎症和肺损伤发生的影响
目的 观察气管滴注硫酸镍对大鼠的急性毒性作用及其机制.方法 将28只体重为280～310g的雄性Wistar大鼠随机分为对照组、硫酸镍低、中、高剂量组,根据镍在细颗粒物中的含量,设计镍的染毒剂量分别为7.5、75和750pg/kg.采用一次性气管滴注染毒,24h后处死动物.收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数.总蛋白(TP)、乳酸脱氢酶(LDH)和炎性因子(IL-6、TNF-a)的测定;收集血液测定血清中炎性因子(IL-6、TNF-a)、C-反应蛋白(CRP)和镍的水平.结果 不同剂量硫酸镍均可引起大鼠BALF中白细胞总数、中性粒细胞数、巨噬细胞显著升高(P＜0.01),较高剂量Ni(75和750pg/kg)可引起BALF中11P水平、LDH活力和炎性因子IL-6、TNF-a水平显著增高(P＜0.05或P＜0.01);硫酸镍染毒24h后,大鼠血清TNF-a水平明显增高,与时照组相比差异有显著性(P＜0.05);血清CRP水平随硫酸镍剂量升高而增高,但仅高剂量组差异有显著性(P＜0.05).此外,随着硫酸镍染毒剂量的增加,血清中镍水平也呈现明显的上升趋势.结论 硫酸镍气管滴注可引起Wistar大鼠急性肺损伤和全身炎症反应,与含相同剂量镍的PM2,相比,硫酸镍的作用较弱,提示镍在PM2.5的毒性作用中可能发挥重要作用,但PM2,中其他成分的作用也不容忽视.
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中药扶正解毒汤含药血清对染镍细胞DNA损伤的影响
目的 研究中药复方扶正解毒汤(FJD)含药血清对镍(NiSO4)致细胞DNA损伤的拮抗作用.方法 培养人支气管上皮细胞系(16HBE)经NiSO4处理后,加入不同剂量FJD含药血清,采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)及单细胞凝胶电泳(SCGE)观察细胞内自由基变化及DNA损伤.结果 NiSO4(1600μmol/L)染毒组彗星样细胞出现率(计数一定量细胞中彗星样细胞所占的比例)、尾长、Olive尾矩、尾DNA%、尾长/头长比及自由基含量均明显高于阴性对照组(P＜0.01);经FJD作用后,上述指标均显著降低(P＜0.05,P＜0.01).结论 FJD含药血清对镍致细胞DNA损伤有一定的拮抗作用,其机制与抑制镍诱导的氧化应激及清除自由基等有关.
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扶正解毒颗粒对染镍大鼠肾组织核因子-κB活化的影响
目的:研究中药扶正解毒颗粒( FJG)对硫酸镍(NiSO4)染毒大鼠肾组织核因子-κB (NF-κB)活化的影响.方法:50只Wistar大鼠采用NiSO42.5 mg·kg-1 ip(连续7d,此后间日1次)制备肾损伤模型,随机分为NiSO4组(模型组)、FJG高、中、低剂量组(分别为20,10,5 g·kg-1 ·d-1),二硫基丁二酸(DMSA),50 mg· kg -1·d-1)组.另设NS组(空白对照)及FJG对照组(FJG 10 g·kg-1·d-1).各组大鼠ig 1次/d,共4周.测定各组大鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)及24 h尿蛋白定量(24 h-UP),免疫组化SP法观察肾组织NF-κB活化.结果:NiSO4组大鼠出现肾功能损伤,NF-κB活化:肾小球(34.62 ±9.11)％,肾小管(62.45 ±14.78)％；FJG大剂量组NF-κB活化:肾小球(2.08±0.64)％,肾小管(11.48±3.39)％,明显低于NiSO4组(P＜0.01),肾功能损伤亦明显减轻(P ＜0.05,P＜0.01).结论:FJG可能通过抑制肾组织NF-κB活性的异常升高而发挥拮抗镍性肾损伤的作用.
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扶正解毒颗粒对染镍大鼠尿微量蛋白及尿酶活性的影响
目的:观察扶正解毒颗粒(FJG)对硫酸镍(NiSO4)暴露肾损伤大鼠的保护作用.方法:50只Wistar大鼠采用NiSO42.5 mg·kg-1·d-1 ip(连续7d,此后间日1次)制备肾损伤模型,随机分为NiSO4组(模型组)、FJG高、中、低剂量组(20,10,5 g·kg-1·d-1)、二巯基丁二酸(DMSA,50 mg·kg-1·d-1)组.另设NS组(空白对照)及FJG对照组(FJG 10 g·kg-1·d-1).各组大鼠ig 1次/d,共4周.分别采用放射免疫法(RIA)、光电比色法及酶法检测尿α1-微球蛋白(α1-MG)、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖甘酶(NAG)及尿肌酐(UCr)的变化.结果:NiSO4组尿α1-MG及NAG活性(NAG/ UCr)较NS组显著增高(P＜0.05和P＜0.01),与NiSO4组相比,FJG各组尿α1-MG及NAG活性则明显降低,尤以FJG高、中剂量组为著(P＜0.05和P＜0.01).结论:尿α1-MG及NAG活性增高与早期镍性肾损伤存在关联,中药FJG对镍性肾损伤大鼠具有较好的保护作用.
关键词： 扶正解毒颗粒 硫酸镍 α1-微球蛋白 N-乙酰Νβ-D氨基葡萄糖苷酶
